RNA二级结构在果蝇Dscam基因外显子4和6互斥可变剪接中的作用研究

摘要

RNA可变剪接是真核生物基因转录后表达调控的重要环节，可极大的增加蛋白质的多样性与生物体的复杂性，RNA的互斥可变剪接是其中一种最复杂的类型，它的机制目前尚无定论。RNA互斥可变剪接即在基因转录生成的前体mRNA中，一组可变剪接外显子（两个及以上）连续排列在一起，但在成熟的mRNA中只有其中的一个成员能被选择剪接保留下来。RNA互斥可变剪接很早就已经被发现，但直至目前，科研人员对互斥可变剪接的调控机制仍知之甚少。模式生物黑腹果蝇（D.melanogaster）Dscam基因是互斥可变剪接研究中最著名的基因，该基因含有四组互斥外显子，可以通过互斥可变剪接形成38016种不同的异构体。尽管RNA互斥可变剪调控机制存在多种假说，并且科学家Gravely在2005年通过生物信息学方法提出了锚定位点-选择序列模型，解释了其中一组互斥外显子的调控模型，然而，这个机制没有在其它的的互斥外显子剪接中发现，不能很好的解释该基因如何巧妙的产生如此多的可变剪接形式。
　　本研究利用生物信息学方法深入分析果蝇20个物种Dscam基因的4号互斥可变外显子序列。分析结果显示，在可变外显子4相关的内含子中存在一些保守的序列元件，类似于Gravely所提出的锚定位点-选择序列剪接机制模型，选择序列位于每个互斥外显子后面的内含子中，锚定位点位于最后面的内含子中，选择序列和锚定位点反向互补形成茎环状的二级结构，选择序列竞争配对锚定位点从而指导外显子4的互斥可变剪接。不同果蝇物种的这些保守选择序列和锚定位点形成的二级结构具有惊人的保守性，提示这些序列保守的元件很可能指导并左右着互斥外显子4的可变剪接情况。随后开展的一系列严谨的实验研究数据证实了我们对这些特定序列功能的猜想。此外，利用生物信息学手段我们发现，在20个果蝇物种的Dscam基因外显子6的锚定位点前面存在一段复杂的内含子序列，它可以形成六个串联排列的紧凑RNA茎环结构，并且该相似的RNA二级结构在其它昆虫物种中具有较好的进化保守性。我们由此推测这段内含子序列是调控果蝇Dscam基因外显子6互斥可变剪接的重要元件。在此科学设想的基础上，我们利用果蝇永生化S2细胞株对Dscam基因表达展开了一些实验研究:通过破坏、互补突变、插入、删除部分保守序列等手段我们检测了该基因互斥外显子6的可变剪接情况。所有的实验结果分析表明:这段可形成六个茎环状的RNA配对结构的内含子序列参与了果蝇Dscam基因外显子6的各互斥外显子的可变剪接，该保守RNA二级结构在互斥可变剪接中起到了极重要的调控作用。
　　本研究利用EMSA实验技术对果蝇14-3-3ζ基因的互斥可变外显子序列、与其内含子序列以及果蝇Dscam外显子6前面的类增强子茎环结构序列与RNA结合蛋白的结合能力进行了分析，结果显示互斥外显子序列倾向于结合SR蛋白、其内含子序列倾向于结合hnRNP蛋白、类增强子序列倾向于结合SR蛋白。这些实验数据说明除了RNA形成的特殊二级结构，一些RNA剪接蛋白可与RNA的序列元件特异结合共同参与RNA互斥可变外显子的可变剪接，后续实验仍在进行中。综上所述，我们对RNA二级结构在模式生物果蝇Dscam基因的互斥可变外显子4和6中的作用研究结果发展了科学家Gravely所提出的RNA互斥可变剪接假说，同时，揭示了这些RNA元件的二级结构在对互斥可变剪接的调控机制的重要意义及其存在的广泛性。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

第1章 文献综述

1．1 前言

1．2 前体mRNA的转录后加工

1．2．1 基因的转录

1．2．2 RNA剪接加工

1．2．3 RNA编辑和修饰

1．3 RNA的可变剪接

1．3．1 RNA可变剪接的发现

1．3．2 RNA可变剪接的类型

1．3．3 RNA可变剪接的重要性

1．3．4 RNA可变剪接的影响因素

1．4 RNA的互斥可变剪接

1．4．1 RNA互斥可变剪接现象

1．4．2 RNA互斥可变剪接的典范——Dscam基因

1．4．3 RNA互斥可变剪接存在的价值和意义

1．4．4 RNA互斥可变剪接作用机制的研究现状

第2章 RNA二级结构对果蝇Dscam基因外显子4互斥可变剪接的影响研究

2．1 序言

2．2 实验内容

2．3 技术路线

2．4 材料与方法

2．4．1 材料与试剂

2．4．2 实验方法

2．5 实验结果与分析

2．5．1 生物信息学分析发现：果蝇Dscam基因互斥外显子4的内含子中的保守序列具有特异性

2．5．2 果蝇Dscam基因互斥外显子4的特异保守序列对互斥外显子4互斥可变剪接的影响

2．5．3 minigene的突变、回复实验

2．6 讨论

2．6．1 果蝇Dscam基因外显子4的内含子中存在保守序列，互补配对形成RNA茎环结构与预测的锚定位点-选择序列模型一致

2．6．2 Minigene构建转染实验证实：内含子RNA形成的保守二级结构对果蝇Dscam基因外显子4的互斥可变剪接具有调控作用

2．6．3 锚定位点-选择序列模型剪接机制是一种适用于多种互斥可变剪接基因的普遍机制

第3章 RNA二级结构对果蝇Dscam基因外显子6互斥可交剪接的影响研究

3．1 序言

3．2 实验内容

3．3 技术路线

3．4 材料与方法

3．5 实验结果与分析

3．5．1 实验设计

3．5．2 构建minigene

3．5．3 通过大片段删除实验寻找锚定位点前内含子序列中的保守元件

3．5．4 锚定位点前面内含子可以形成特殊的六叶形二级结构

3．5．5 内含子中这六个茎环结构的删除会明显降低剪接效率

3．5．6 单个内含子茎环结构可以部分取代整体六个茎环结构的作用

3．5．7 这种六个茎环结构的组成形式在果蝇物种中是保守的

3．5．8 在其他昆虫物种中也存在相似的结构

3．5．9 在昆虫纲以外的甲壳纲物种水蚤中也存在相似的结构并通过实验证实

3．6 讨论

3．6．1 果蝇Dscam基因外显子5、6之间内含子分段删除实验证实该800bp片段内存在特异调节该基因外显子6互斥可变剪接机制的元件

3．6．2 果蝇Dscam基因外显子5、6之间内含子可形成保守的有六个茎环结构的RNA二级结构

3．6．3 果蝇Dscam基因外显子5、6之间内含子形成的保守二级结构的每一个茎环结构都单独具备增强子的功能

3．6．4 其它物种Dscam基因外显子5、6之间的内含子也存在类似的六个茎环结构组成的RNA二级结构

第4章 RNA结合蛋白与特异RNA序列的互作研究

4．1 序言

4．2 技术路线

4．3 材料与方法

4．3．1 材料与试剂

4．3．2 实验方法

4．4 实验结果与分析

4．4．1 RNA结合蛋白的原核表达

4．4．2 原核表达蛋白的纯化

4．4．3 目标RNA的制备

4．4．4 EMSA实验验证RNA结合蛋白与目标RNA的结合能力

4．5 讨论

4．5．1 RNA结合蛋白的成功表达和纯化

4．5．2 EMSA实验——果蝇14-3-3ζ基因互斥外显子和内含子特定序列和果蝇Dscam基因外显子6的类增强子序列与RNA结合蛋白的亲和力分析

第5章 展望

博士在读期间的学术成绩

参考文献