RNA二级结构在果蝇Dscam外显子簇6互斥可变剪接中的调控功能研究

摘要

可变剪接是多细胞真核生物中RNA转录后加工的一种形式，是增加蛋白质多样性的重要途径，在决定物种特异性及组织特异性分化方式上具有重要的作用，与许多遗传性疾病和癌症的发生都有着密切的关系。互斥可变剪接是可变剪接的一种类型，它只能选择一个可变外显子进入成熟mRNA;选择不同的可变外显子，会形成不同的mRNA，进而形成多种蛋白质异构体。互斥可变剪接的发生是一个复杂而又精细的调控过程，大量的剪接调控蛋白和不同的RNA二级结构都参与其中，具体的调控机制多种多样，仍有待补充和完善。
　　黑腹果蝇的Dscam基因是互斥可变剪接的经典案例，Dscam基因与果蝇神经系统的分化和先天免疫系统的发生密切相关，它经过四个外显子簇的可变剪接可以产生38016种不同的蛋白质异构体，但Dscam基因剪接的调控机制却不是很清楚。我们实验室已经用实验证明了锚定位点-选择序列互补配对调控Dscam基因互斥可变剪接的假说，并发现和证实了LCR元件对Dscam基因外显子簇6互斥可变剪接的调控机制。且Dscam基因含有四个可变外显子簇，共计95个可变外显子，其复杂而又精细的可变剪接调控机制仍有待继续丰富和拓展。
　　该研究首先通过生物信息学方法在Dscam基因外显子簇6的最后一个可变外显子6.48与组成型外显子7之间的内含子上发现两个保守的顺式元件，且它们可以反向互补配对形成二级结构，且该二级结构在11种果蝇中保守;再通过突变实验、回复突变实验和删除实验证实了该二级结构能够正向调节Dscam基因外显子簇6剪接的可变外显子总体选择比例，但是不能决定特定的外显子的选择情况;该研究结果还指出，靠近组成型外显子7的内含子元件中可能还存在一些重要的剪接调控蛋白的结合位点，这一假设为后续的研究提供了新的方向，对我们深入认识Dscam基因的可变剪接调控机制具有重要的理论指导意义。

目录

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致谢

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．1 真核生物互斥可变剪接的研究进展

1．1．1 剪接

1．1．2 可交剪接

1．1．3 可变剪接的类型

1．1．4 可交剪接的意义

1．1．5 RNA二级结构与可交剪接

1．1．6 互斥可变剪接的产生及调控机制

1．2 黑腹果蝇Dscam互斥可变剪接研究进展

1．2．1 黑腹果蝇Dscam基因

1．2．2 黑腹果蝇Dscam基因外显子簇6的互斥可变剪接调控模型

1．2．3 黑腹果蝇Dscam基因外显子簇4和9的互斥可变剪接模型

1．2．4 罴腹果蝇Dscam基因外显子簇17的互斥可变剪接模型

第二章 实验方案

2．1 研究目的及研究意义

2．1．1 研究目的

2．1．2 研究意义

2．2 研究内容

2．3 技术路线

2．4 载体结构图

第三章 材料与方法

3．1 材料与试剂

3．2 实验方法

3．2．1 黑腹果蝇及其他11种果蝇物种Dscam序列分析

3．2．2 果蝇物种Dscam外显子6.48和外显子7之问的序列二级结构预测

3．2．3 引物设计

3．2．4 黑腹果蝇成虫基因组提取

3．2．5 PCR扩增

3．2．6 PCR产物的割胶回收

3．2．7 PCR产物与T载体连接反应

3．2．8 E.coli TG1感受态细胞的制备(CPG法)

3．2．9 连接产物转化感受态细胞

3．2．10 挑斑及菌液培养

3．2．11 质粒DNA提取

3．2．12 质粒DNA酶切鉴定

3．2．13 目的基因片段测序

3．2．14 minigene表达载体杓建

3．3．15 重组表达载体浓度测定

3．2．16 minigene表达载体转染果蝇S2细胞

3．2．17 转染细胞总RNA提取

3．2．18 RNA逆转录反应

3．2．19 RT-PCR反应

3．2．20 RT-PCR产物酶切分析检测

3．2．21 净光密度分析

第四章 实验结果分析与讨论

4．1 果蝇Dscam基因可变外显子6.48后两个内含子元件具有物种特异性

4．2 minigene表达载体与各突变载体构建

4．2．1 minigene表达载体构建

4．2．2 突变载体构建

4．2．3 黑腹果蝇Dscam外显子6.48后的二级结构调控Dscam外显子6可变剪接的研究结果

4．3 讨论

研究创新点及展望

参考文献

个人简历