ART对人早孕期胎儿印记基因表达和修饰的影响及其对出生儿血脂代谢改变及相关机制研究

摘要

随着以体外受精-胚胎移植（in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）和卵细胞浆内单精子注射（intracytoplasm sperm injection，ICSI）为代表的现代辅助生殖技术(assisted reproductive techniques，ART)不断推广应用，全世界ART出生儿已经超过数百万。已有不少的流行病学研究显示，除低出生体重儿发生增多、早产和新生儿出生缺陷率升高之外，ART子代还增高了BW综合症(Beckwith-Wiedemann syndrome)和Angelman综合症(Angelman syndrome)等印记紊乱疾病的发生风险。许多动物实验亦证明ART过程可对出生子代的H19、 Ascl2、Peg3、Xist等印记基因的表观遗传学修饰和表达产生影响。但受材料获取的限制，人类的相关分子机理研究主要局限在分娩后的脐血和胎盘组织和ART儿童的外周血，另有少部分利用的是废弃或多余的IVF着床前胚胎。从具有向机体各类组织细胞分化潜能的全能性卵裂球或内细胞团细胞，到着床后分化生长的三胚层细胞，到各组织器官细胞的分化形成、直至新生儿的出生，人类细胞的基因组印记从修饰、调控、到表达发生了复杂的分子生物学变化，人类对ART宫内早期生长阶段的胎儿组织有关基因表达和修饰影响研究的极度匮乏，是我们目前了解ART过程影响出生子代基因组表观遗传学健康发生发展过程的难点之一。
　　早在1995年英国学者Barker提出了著名的“胎儿源性疾病学说”，认为胎儿期宫内发育不良或生长过度导致的出生儿体重改变，与成年后肥胖、糖尿病、高血压等疾病联系紧密。其中胎儿宫内营养改变，导致成年后脂肪代谢异常、胰岛素抵抗、动脉血压增高和肾脏结构改变已被多个研究证实。2010年，Motrenko等进一步提出“疾病胚胎起源学说”，认为胚胎形成时期外界不良因素可增加成年后慢性疾病的发生率，其中不良环境暴露引起的配子、胚胎和胎儿组织表观遗传学修饰改变，被认为是重要的发病机理之一。ART对配子成熟、精卵结合和胚胎生长过程的干扰，ART儿出生体重和表观遗传学修饰改变的证据，均与“胚胎-胎儿源性疾病”的发病机理相类似，提示ART子代存在因胚胎/胎儿因素，导致成年后诸如心血管疾病一类疾病发生风险上升的可能。现已有证据表明，人类ART出生儿存在血压增加、空腹血糖和血脂水平升高的趋势。我们研究小组先行开展ART小鼠模型研究显示，老年（1.5周岁）ART小鼠存在血压、心率、血脂、糖耐量和胰岛素水平的显著性改变，其发生和发展与脂代谢重要调节通路——胰岛素诱导基因(insulin-induced gene，INSIG)，SREBP裂解激活蛋白(sterol regulatoryelement-binding protein cleavage-activating protein，SCAP)和类固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)基因的表达和修饰改变存在联系。但迄今为止，人类ART子代有关血脂代谢改变的发生机理研究仍鲜有报道，有关人ART胎儿、胎盘组织INSIG-SCAP-SREBP通路基因表达和修饰改变的研究仍为空白。
　　2007年Kobayashi等发现少精子症患者精子存在印记位点甲基化的异常，男性不育患者的精子会含有表观遗传异常的印记基因，并具有将此缺陷遗传给子孙的风险，且精子质量越差，甲基化印记改变越明显。后来有学者对绒毛DNA和相对应的精子DNA同时进行检测，证实了精子细胞携带的异常印记可以传递到子代绒毛，Kobayashi等的研究进一步发现，41％的子代DNA甲基化异常可以在父亲精子中找到相同的异常改变，这也进一步提示印记基因的异常改变有可能源自于父亲精子本身的印记异常。ICSI技术是当前男性不育治疗最为有效的方法，但其在克服精子数量、活力、形态异常引起的受精障碍的同时，也跨越了的机体的自然选择机制，使存在遗传或表观遗传学异常的精子与卵子受精发育，使出生子代携有同样遗传或表观遗传学异常后代的风险升高。故此，研究用于ICSI的少弱精子症患者的精子DNA的表观遗传学修饰改变，有助于人类ICSI后代表观遗传学改变的病因学分析。
　　旨在为揭示ART子代印记基因表达修饰改变提供胎儿组织依据，考察ART出生儿血脂代谢改变发生发展的分子生物学机制，我们分别收集IVF、ICSI和单纯药物卵巢刺激（control ovarian stimulation，COS）的三胎妊娠胚胎减灭术后的早孕期胎儿组织，以及IVF、ICSI和自然妊娠足月分娩的脐血、胎盘组织，分别进行了ART早孕期胎儿印记基因表达及其差异甲基化区域修饰变化、ART对出生儿血脂代谢的影响及其机制的研究。并且在发现ICSI胎儿、胎盘存在血脂代谢调节基因甲基化修饰显著性改变的基础上，进行了ICSI少弱精子症精子基因DNA甲基化的改变研究。本文从以下及部分进行了阐述。
　　第一部分ART早孕期胎儿印记基因表达及其差异甲基化区域修饰变化研究。
　　目的:
　　考查生长发育相关印记基因IGF2, H19和神经系统功能相关印记基因SNRPN,UBE3A在ART早孕期胎儿组织中表达和甲基化状态的改变，为揭示ART子代印记基因表达修饰改变提供胎儿组织依据。
　　材料和方法:
　　1分别收集IVF、ICSI和单纯药物卵巢刺激(control ovarian stimulation，COS)的三胎妊娠胚胎减灭术病例，获取早孕期胎儿组织。
　　2分别提取上述三组患者早孕期胎儿组织的RNA，实时定量RT-PCR(quantitativereal time RT-PCR)检测各标本印记基因IGF2，H19, SNRPN和UBE3A的mRNA表达水平，比较其在IVF、ICSI和COS三组间的表达差异。
　　3分别提取上述三组患者早孕期胎儿组织的DNA，焦磷酸测序(pyrosequencing)检测各标本印记基因IGF2, H19, SNRPN和UBE3A印记基因差异甲基化区域(differentiation methylation regions，DMRs)的甲基化修饰状态，比较三组间的甲基化修饰差异。
　　结果:
　　1印记基因的表达水平分析:
　　(1) IVF组的H19表达水平显著性高于COS组(P＜0.05);但IVF组与ICSI组，ICSI组与COS组间比较，H19表达水平无显著性差异(P＞0.05);
　　(2) IGF2, SNRPN和UBE3A表达水平在IVF组、ICSI组和COS组间均无显著性差异(P＞0.05)。
　　2印记基因差异甲基化区域的甲基化水平
　　(1) IVF组和ICSI组的IGF2 DMR甲基化水平均显著性高于COS组(P＜0.05);IVF组和ICSI组间差异无显著性(P＞0.05);
　　(2) IVF组和ICSI组的H19 DMR甲基化水平均显著性低于COS组(P＜0.05)，IVF和ICSI组间差异无显著性(P＞0.05);
　　(3) IVF组与ICSI组的SNRPN DMR甲基化水平显著性高于COS组(P＜0.05)，IVF和ICSI组间无显著性差异(P＞0.05);
　　(4) IVF组、ICSI组和COS组的UBE3A DMR的各CpG位点甲基化水平无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　(1)人类ART的精卵体外处理、辅助受精、或受精后胚胎的体外培养可影响早孕期胎儿组织印记基因IGF2, H19和SNRPN DMR的甲基化修饰，但ART过程中最具损伤性的ICSI过程的此类影响不明显。
　　(2)虽然ART可显著改变早孕胎儿组织多个印记基因DMR的甲基化修饰，但同时能够显著改变基因转录水平的只有H19，提示早孕胎儿组织印记基因存在纠正/减低ART引发的甲基化修饰改变表观遗传学效应的调控机制。
　　(3) IVF早孕期胎儿组织中H19呈低甲基化和高表达水平，推测可能和ART所致的低出生体重风险增加有关。
　　第二部分ART对出生儿血脂代谢的影响及其机制研究。
　　目的:
　　考查ART出生儿血脂生化指标的改变;检测ART早孕期胎儿组织和足月胎盘组织脂代谢重要调节通路INSIG-SCAP-SREBP的基因表达，及其调节区CpG位点的甲基化修饰状态，阐明ART出生儿血脂生化指标改变发生发展的分子生物学机制。
　　材料和方法:
　　1收集IVF、ICSI和COS三胎妊娠胚胎减灭术后的早孕期胎儿组织，以及IVF、ICSI和自然妊娠(natural conception，NC)足月单胎剖宫产分娩的脐血、胎盘组织及相应的母血。
　　2测定脐血和母亲血清甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平，比较他们在IVF、ICSI和自然妊娠三组间的差异。
　　3分别提取上述各组早孕期胎儿组织和足月胎盘组织的RNA，实时定量RT-PCR检测各标本NSIG1，INSIG2，SCAP，SREBF1，SREBF2的mRNA表达水平，比较其在三组间的表达差异。
　　4选择mRNA表达有显著性差异的上述目的基因，应用焦磷酸测序法检测上述三组早孕期胎儿组织和足月胎盘组织中各基因调节区CpG位点的甲基化修饰状态，比较其在三组间的甲基化修饰差异。
　　结果:
　　1 ICSI新生儿脐血中甘油三酯水平显著高于IVF组和NC组(P＜0.05)。
　　2 ICSI组胎儿组织INSIG1 mRNA的水平显著性高于IVF组和COS组(P＜0.05);和IVF组和自然妊娠组比较，ICSI胎盘组织INSIG1 mRNA的水平高度显著性升高(P＜0.01)。
　　3与自然妊娠组比较，ICSI胎盘组织SREBF1mRNA的水平显著性增高(P＜0.05)。
　　4无论是胎儿还是胎盘组织，INSIG2,SCAP和SREBF2 mRNA的水平在各组间的表达均无显著性差异(P＞0.05)。
　　5在胎儿组织中，ICSI组INSIG1的5个CpG位点中有4个位点甲基化水平显著性低于IVF组和COS组(P＜0.01);IVF组和COS组比较，其甲基化水平无显著性差异(P＞0.05)。
　　6在胎盘组织中，IVF和ICSI组INSIG1的5个CpG位点甲基化水平均显著性低于自然妊娠组，其中ICSI组INSIG1呈去甲基化状态(P＜0.01);此外在SREBF1的7个CpG位点中，在IVF组有2个，ICSI组有3个位点的甲基化水平显著性低于自然妊娠组(P＜0.01)。
　　结论:
　　1 ICSI可显著影响胎儿组织INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的mRNA表达水平，其发生机理与相应基因启动子区CpG位点的甲基化修饰水平改变有关。
　　2 ICSI引起的INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的表达和甲基化修饰改变可在妊娠足月胎盘组织得以进一步的增强，并可能与ICSI新生儿脐血甘油三酯水平的显著性升高相关。
　　3 IVF亦可导致胎盘组织INSIG-SCAP-SREBP通路部分基因的甲基化修饰改变，但改变程度相对要轻，对相应基因表达及其出生儿血脂代谢的影响不明显。
　　第三部分少弱精子症精子中印记及非印记基因DNA甲基化的改变。
　　目的:
　　选取之前发现在ART胎儿和胎盘组织中存在甲基化修饰改变的印记基因IGF2，H19，SNRPN以及非印记基因INSIG1，SREBF1，考察他们在不同的ART精子中的DNA甲基化状态。
　　材料和方法:
　　1收集ART过程中受精完成后剩余的精子，根据术前精子参数分为正常精子组（用于IVF受精）和少弱精子症组（用于ICSI受精）。
　　2用焦磷酸测序方法检测精子IGF2，H19，NRPN，INSIG1，SREBF1启动子区的甲基化修饰状态，比较其在不同ART精子中的甲基化水平是否存在差异。
　　结果:
　　1少弱精子症精子IGF2, SNRPN和INSIG1各CpG位点的甲基化水平和正常精子相似，差异无显著性(P＞0.05)。
　　2少弱精子症精子H19的6个CpG位点中有5个位点甲基化水平显著低于正常精子（其中CpG3，CpG4:P＜0.01;CpG2，CpG5，CpG6:P＜0.05）。
　　3和正常精子相比，少弱精子症精子在SREBF1的7个CpG位点中有2个位点（CpG3:P＜0.01和CpG4:P＜0.05）甲基化水平显著高于正常精子。
　　结论:
　　1少弱精子症精子中存在印记基因H19和非印记基因SREBF1的甲基化状态改变。
　　2印记基因IGF2,SNRPN和非印记基因INSIG1在少弱精子症精子中未见异常甲基化改变。
　　3 ART尤其是ICSI胎儿和胎盘中印记基因和非印记基因的甲基化修饰改变并非和相应精子中的改变趋势一致，说明ICSI所引起的子代表观遗传改变并非完全来自父亲的不育背景，ART的各项操作对子代表观遗传改变的影响仍需得到重视。