HPV相关miRNA参与HPV免疫逃逸的分子机制及基于miRNA骨架的RNA干扰载体的效应研究

摘要

研究背景与目的：
　　尖锐湿疣(Condyloma acuminatum，CA)是临床上最常见的性传播性疾病之一，具有潜伏期长、反复发作、治疗迁延的特点，严重危害了患者的身心健康、家庭幸福和社会安定，也为性传播性疾病的防控带来棘手难题。因此，针对HPV感染的免疫逃逸机制进行研究，探寻理想靶标进行复发风险评估，进而研制有效的治疗性药物以减少CA的反复发作具有重要意义。
　　研究证明HPV在亲嗜上皮细胞后实现长期潜伏而导致感染迁延难愈的主要原因是:HPV入侵宿主细胞后，一方面通过干扰信号转导和转录活化因子的形成导致干扰素产生及活化的下调，以及下调角质形成细胞内包括前炎症因子、趋化因子等的细胞因子反应;另一方面亦可通过干扰角质形成细胞的抗原递呈及CD8+CTL的活化从而导致宿主不能启动有效的细胞免疫应答。近年来越来越多的研究表明，miRNA在基因表达调控网络中发挥广泛而重要的作用，寻找miRNA分子及其靶基因的研究正成为基因调控领域的重要分支和热点。然而miRNA分子是否也参与了HPV感染细胞免疫逃逸的调控，目前仍然不清楚。
　　由Pol-Ⅱ RNA酶转录和剪切产生的miRNA是被高度调控的，模拟miRNA的框架结构设计shRNA可实现特异性靶向肿瘤或组织的基因沉默，且合理设计的PolⅡ启动子调控的miR-shRNA的基因沉默效率可显著高于PolⅢ启动子所调控的shRNA。
　　本课题第一部分筛选和鉴定出参与调控HPV免疫逃逸的miRNA分子，通过miRNA功能获得和缺失实验，观察目标miRNA时序性变化在体内外多个HPV感染模型中引起的免疫逃逸相关通路上目标靶基因表达及下游效应的改变，并通过荧光素酶报告实验进行验证，旨在揭示miRNA在HPV感染免疫逃逸调控中的作用、机制和主要调控靶点。为发现阻断CA反复发生的新靶点及开发CA miRNA治疗药物提供科学依据。
　　本课题第二部分构建了基于miR-30骨架的RNAi载体，并观察和比较其效应和安全性，旨在研究和探寻更为理想的治疗性RNAi载体，拓展抗病毒和抗肿瘤治疗的新思路。
　　研究方法;
　　1.临床研究
　　收集5例HPV-6b阳性的男性CA样本及其HPV阴性的自身对照包皮，通过miRNA芯片筛查miRNA的差异表达。扩大样本收集60例CA患者皮损和20例健康对照者包皮，荧光定量PCR法验证CA皮损中miRNA的差异表达，并与临床性征进行相关性分析。利用生物信息学技术构建差异表达miRNA-靶基因的调控网络。
　　2.miR-31的模拟物和抑制物的构建及其功能和调控靶基因的确定和验证
　　构建pre-miR-31模拟物和miR-31抑制物的慢病毒载体，分别作用HeLa细胞、SiHa细胞以及HaCaT细胞，观察miR-31对细胞增殖和凋亡的影响;并用Poly(I:C)刺激各组细胞，以ELISA检测各组细胞上清中炎症性细胞因子、Ⅰ型或Ⅱ型干扰素和趋化因子表达的变化;利用基因芯片技术结合生物信息学预测结果，筛选出miR-31可能调控的下游靶基因，以荧光定量PCR进行筛选，并以荧光素酶报告实验进行验证，确定出调控靶基因。
　　3.构建基于miR-30骨架的RNAi载体并进行效应评价
　　设计3条基于miR-30骨架的和普通构型的HPSE-shRNA，利用基因重组技术包装出LVPP-GFP/HPSE-miRNAs和LVpGCSIL-GFP/HPSE-shRNAs慢病毒。在体外通过荧光定量PCR法和westernblot法比较LV PP-GFP/HPSE-rniRNAs和LVpGCSIL-GFP/HPSE-shRNAs对HPSE基因和蛋白表达的干扰效果，以细胞粘附实验、Transwell迁移实验和Matrigel侵袭实验比较两者对黑素瘤A375细胞粘附、迁移和侵袭能力的影响.在裸鼠动物模型上观察和比较LVPP-GFP/HPSE-miRNA和LVpGCSIL-GFP/HPSE-shRNA对皮下成瘤、黑素瘤体内转移及毒副作用的比较。
　　研究结果:
　　1.CA样本中miRNA的差异表达
　　(1) miRNA芯片结果中，实验样本和对照样本表达上调或下调4倍以上且阳性信号反应值＞500的miRNA作为差异表达miRNA，其中以miR-31表达增高最为显著。
　　(2)荧光定量PCR扩大验证结果中除了miR-195和miR-30b表达无明显差异外，其余miRNA均有差异表达，其中miR-31表达增高最为显著。miR-31的表达与发作次数和病程密切相关，且与病程呈正相关。
　　(3)构建出CA差异表达miRNA-基因调控网络图。
　　2.miR-31对HPV感染细胞及角质形成细胞增殖、凋亡以及细胞因子表达的影响，及其调控靶基因的筛选和验证
　　(1)成功构建了表达pre-miR-31模拟物和miR-31抑制物的重组慢病毒。建立了稳定感染并表达pre-miR-31模拟物和抑制物的HeLa细胞、SiHa细胞和HaCaT细胞。
　　(2) MTT结果显示稳定表达miR-31模拟物和抑制物的HeLa细胞、SiHa细胞组间细胞增殖和活力无显著差异（P≥0.05），时序性miR-31差异表达组间细胞增殖无明显差异（P≥0.05）。Annexcin-V-PE凋亡检测结果显示稳定表达miR-31模拟物和抑制物的HeLa细胞和SiHa细胞组间凋亡细胞比例无显著差异（P≥0.05）。
　　(3) ELISA结果显示，在poly(I:C)的协同刺激下，miR-31抑制物能够促进HeLa和SiHa细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和IL-6、趋化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及Ⅰ型干扰素IFN-α和IFN-β(P＜0.05);能够促进HaCaT细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和IL-6、趋化因子IL-8、CXCL-1和RANTES以及Ⅰ型干扰素IFN-β和Ⅱ型干扰素IFN-γ（P＜0.05）。
　　(4)根据差异表达miR-31的HeLa细胞组间基因差异表达谱的结果，结合软件预测结果筛选出miR-31可能调控的下游靶基因——MAP3K1、MAP3K14、MAP4K5、HLA-A、IRF1和PKC等，差异基因位于MAPK/NFκB信号通路上。荧光定量PCR检测及westemblot实验证实差异表达miR-31组间MAP3K1的表达有显著差异(P＜0.05)。
　　(5)成功构建出MAP3K13'UTR野生型和突变型载体。荧光素酶报告实验显示miR-31模拟物对野生型载体中的报告荧光有明显的下调作用;对其预测靶位点进行突变后，突变型载体中的报告荧光有所恢复(P＜0.05)。
　　3.基于miR-30骨架的RNAi载体的构建及效应比较
　　(1)成功构建出基于miR-30骨架的靶向HPSE的RNAi载体LV PP-GFP/HPSE-miRNAs慢病毒，以及常规构型的LV pGCSIL-GFP/HPSE-shRNAs慢病毒。
　　(2)体外实验结果显示，与空白对照和各自的阴性对照比较，MOI=10时各LVPP-GFP/HPSE-miRNAs组和LVpGCSIL/HPSE-shRNAs组HPSE表达下调有显著差异，并在体外能够抑制A375细胞的增殖、粘附、迁移和侵袭能力（P＜0.05）。但三VPP-GFP/HPSE-miRNA和LV pGCSIL/HPSE-shRNA组间比较无显著差异）（P≥0.05）。
　　(3)体内效应实验结果显示，与空白对照和各自的阴性对照比较，LVPP-GFP/HPSE-miRNA组和LV pGCSIL/HPSE-shRNA组皮下肿瘤的体积、肺脏转移灶的数目明显减少(P＜0.05)，但两组间比较无显著差异（P≥0.05）。但LVPP-GFP/miRNA组引起肝脏炎症灶、肺脏水肿和炎症灶的数量和程度较LVpGCS IL/shRNA组明显减轻(P＜0.05)。
　　研究结论:
　　(1) CA组织中有多个有意义的差异表达的miRNA分子，其中以miR-31表达增高最为显著。
　　(2) miR-31在HPV感染细胞中不参与细胞增殖和凋亡，其抑制物上调细胞前炎症因子、趋化因子和Ⅰ型干扰素的产生;其调控机制与miR-31下调MAPK/NFκB信号通路中的MAP3K1有关。
　　(3)基于miRNA骨架的RNAi载体能够有效下调靶基因的表达，且引起更少的肺脏和肝脏的毒副作用。