NF--κB通路在二氢青蒿素诱导肿瘤细胞自噬中的作用机制研究

摘要

自噬是真核细胞利用溶酶体降解大分子物质的途径，它通过形成双层膜结构包裹细胞内受损的细胞器及其它大分子物质，再运送到溶酶体中降解成氨基酸、脂肪酸和核苷等基本单元，从而维持细胞正常的能量循环。肿瘤是最早发现与自噬相关的疾病之一。然而，自噬在肿瘤发生和发展中的作用却尚无定论。一方面，自噬可促进肿瘤生存并维持其活性，帮助肿瘤细胞抵御低氧、营养缺乏、DNA损伤和氧化应激等不利环境;另一方面，自噬也可以作为肿瘤细胞死亡的途径，并且在某些情况下还可能诱导肿瘤细胞发生凋亡。 NF-κB是另一种在肿瘤的形成和增殖过程中起重要作用的核转录因子，它可以通过上调IAPs家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、JNK、c-FLIP等与细胞存活、增殖相关的基因表达或诱导凋亡抑制基因过表达而发挥抗凋亡作用。许多肿瘤细胞中均存在NF-κB的持续高表达及IκBα的突变失活或降解异常，导致上调多药耐药基因的表达水平，使肿瘤细胞产生抗药性。因此，通过阻滞NF-κB活化已成为治疗某些肿瘤的新策略。 青蒿素(Artemisinin)是我国研究者在二十世纪七十年代首次从菊科植物黄花蒿(Artemisia annua Linn)中提取的一种新型倍半萜内酯。二氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢物。近年来的研究证实，二氢青蒿素具有良好和广谱的抗肿瘤活性。本课题组的前期研究也表明，二氢青蒿素对肺癌(Lewis)、人多发性骨髓瘤(RPMI8226)以及白血病(K562，HL60)细胞等多种肿瘤细胞的增殖均具有明显的抑制效果。我们最近又发现二氢青蒿素能显著诱导多株肿瘤细胞发生自噬反应。关于二氢青蒿素诱导肿瘤细胞发生自噬的作用还未见报道，其具体机制更不甚清楚。本论文选取人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株作为主要研究对象，重点考察NF-κB通路在二氢青蒿素诱导肿瘤细胞自噬中的作用机制。 结果: 1.DHA诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞发生自噬 RPMI8226细胞经DHA(10μM，20μM，40μM)作用24h后，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ型的表达明显上调，p62的表达下调，并且LC3蛋白由对照组的弥散状态变成明显点状聚集，且主要分布在细胞质中。吖啶橙染色后，通过荧光显微镜和流式细胞仪分别发现，DHA(10μM，20μM，40μM)作用24h后，RPMI8226细胞内酸性自噬泡的数量明显增加。细胞经氯喹(5μM，30min)预处理后，发现氯喹可增强DHA(20μM，24h)诱导RPMI8226细胞内LC3-Ⅱ的表达水平。经DHA(20μM，24h)作用后，通过透射电镜也观察到细胞内自噬泡数量明显增加，而且其中包裹有类似线粒体样内容物。通过Mitotracker Red对线粒体染色，分析LC3蛋白与线粒体的共定位情况，发现DHA作用后两者共定位情况明显增加。 2.DHA通过抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞中NF-κB的激活导致自噬反应发生 2.1 DHA抑制RPMI8226细胞内NF-κB的活性 RPMI8226细胞经DHA(10μM，20μM，40μM)作用12h后，在全细胞范围内，IκBα蛋白的表达水平明显上调，磷酸化IκBα蛋白水平下调，p65的表达却基本保持不变;在细胞核和细胞质中，DHA分别下调和上调p65蛋白的水平。通过免疫荧光对p65蛋白染色，发现正常细胞内p65弥散分布在细胞核和细胞质中;DHA作用后，p65主要分布在细胞质中。EMSA分析的结果也显示，RPMI8226经DHA(10μM，20μM，40μM)作用12h后，NF-κB结合反应元件的能力逐渐下降。 2.2 TNF-α逆转DHA抑制RPMI8226细胞内NF-κB活性的作用 在全细胞范围内，DHA(20μM)作用12h后分别造成IκBα蛋白累积的增加和磷酸化Iκ Bα蛋白的减少;细胞经TNF-α(20 ng/ml，30min)预孵育后，IκBα蛋白和磷酸化IκBα蛋白的水平分别发生下调和上调。在细胞核和细胞质中，DHA单用分别减少和增加p65蛋白的水平;细胞经TNF-α预处理后，p65蛋白的水平分别发生上调和下调。EMSA分析也发现，单用DHA(20μM，12h)可抑制RPMI8226细胞内NF-κB结合反应元件的能力;细胞经TNF-α(20ng/ml，30min)预处理后，NF-κB结合反应元件的能力得到增强。 2.3DHA抑制NF-κB活性与诱导自噬反应的时效变化分析 时效分析的结果发现，RPMI8226细胞经DHA(20μM)作用12h后，磷酸化IκBα蛋白的表达开始减少，同时IκBα蛋白累积增加;另一方面，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达一直到24 h才明显上调。 2.4 TNF-α逆转DHA诱导RPMI8226细胞发生的自噬反应 RPMI8226细胞经DHA(20μM，24h)作用后，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达明显增加，细胞经TNF-α(20ng/mL，30min)预孵育后，DHA诱导的LC3-Ⅱ累积明显减少。另一方面，DHA(20μM，24h)处理可显著增加RPMI8226细胞内自噬泡的数量;细胞经TNF-α(20ng/mL，30 min)预孵育后，DHA诱导生成的自噬泡数量明显减少。 2.5过表达p65逆转DHA诱导RPMI8226细胞内发生的自噬反应 通过慢病毒方法在RPMI8226细胞内表达p65质粒。Western Blot的结果显示，与空白质粒相比，经慢病毒感染的RPMI8226细胞内p65蛋白的表达显著增加。正常RPMI8226细胞和稳定表达p65质粒的RPMI8226细胞经DHA(20μM，12h)作用后，通过核质分离方法分别得到两种细胞的核蛋白，再通过Western Blot方法检测两种细胞核内p65蛋白表达的变化。发现与空白对照组细胞相比，DHA可分别下调两种细胞核内p65蛋白的表达，但是在表达p65质粒的RPMI8226细胞的核内，p65的水平还是较正常细胞显著上调。 再通过Westem Blot方法检测两种细胞经DHA作用后，自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达的变化。结果发现，经梯度浓度的DHA(10μM，20μM，40μM)作用后24h后，正常RPMI8226细胞内LC3-Ⅱ蛋白出现累积;反之，在表达p65质粒的RPMI8226细胞内，DHA作用后LC3-Ⅱ蛋白并未出现明显变化。进一步对药物处理后的两种细胞进行AO染色，再通过流式细胞仪定量检测细胞内自噬泡数量的变化。结果发现，经梯度浓度的DHA(10μM，20μM，40μM)作用24h后，正常RPMI8226细胞内，自噬泡数量明显上调;相反，在表达p65质粒的RPMI8226细胞内，自噬泡数量未出现显著变化。 3.DHA抑制NF-κB活性导致自噬也发生在早幼粒白血病NB4细胞，结肠癌HCT116细胞和宫颈癌Hela细胞中 DHA作用于NB4细胞(10μM)、HCT116细胞(5μM)和Hela细胞(5μM)24h后，三株细胞内自噬相关蛋白LC3-Ⅱ均出现累积增加;反之，预孵育TNF-α(20ng/ml，30 min)后，DHA诱导LC3-Ⅱ蛋白的表达均出现下调。进一步对DHA处理后的三株细胞进行AO染色，再通过流式细胞仪定量检测细胞内自噬泡数量的变化。结果发现，DHA作用均可导致三株细胞内自噬泡数量的明显增加;反之，预孵育TNF-α后，DHA诱导生成的自噬泡数量均出现下调。 4.DHA诱导肿瘤细胞发生自噬与活性氧(ROS)的过度产生有关 4.1 DHA上调RPMI8226细胞内ROS的水平 RPMI8226细胞经DHA(10μM，20μM，40μM)作用15h后，采用DHE染色，再通过流式细胞仪定量检测细胞内ROS的水平。结果发现DHA作用后，细胞内ROS的水平明显发生上调。 4.2 DHA抑制RPMI8226细胞内FHC和MnSOD的活性 Western Blot结果显示，梯度浓度的DHA(10μM，20μM，40μM)作用15h可明显下调RPMI8226细胞内FHC和MnSOD蛋白的表达。再通过试剂金检测细胞内总SOD的活性，结果发现，经DHA(10μM，20μM，40μM)处理后的RPMI8226细胞内总SOD的活性呈梯度下调。 4.3 TNF-α逆转DHA抑制RPMI8226细胞内FHC和MnSOD活性的作用 DHA(20μM，15h)单用可分别下调细胞内FHC和MnSOD蛋白的表达水平;反之，TNF-α(20 ng/ml，30 min)预处理后，DHA对FHC和MnSOD蛋白表达的抑制作用均有一定程度的逆转。 4.4 TEMPO逆转DHA诱导肿瘤细胞发生的自噬反应 DHA(20μM，24h)单用可分别导致两株细胞内LC3-Ⅱ蛋白的累积;相反，细胞经TEMPO(2mM，30min)预处理后，DHA诱导LC3-Ⅱ的表达明显减少。进一步通过AO对经DHA和TEMPO处理后的RPMI8226细胞和NB4细胞进行染色，再通过流式细胞仪定量检测两株细胞内自噬泡的数量。结果发现，DHA(20μM，24h)单用可分别上调两种细胞内自噬泡的数量;反之，TEMPO(2mM，30min)预处理后，两株细胞内DHA诱导生成的自噬泡数量明显减少。 5.DHA诱导RPMI8226细胞发生凋亡与NF-κB活性被抑制有关 PI单染的结果显示，RPMI8226细胞经DHA(20μM)作用24小时后，凋亡率明显增加。细胞预孵育TNF-α(20ng/mL，30min)后，再用DHA处理，凋亡率显著减少。 上述研究结果表明，①DHA诱导自噬反应主要是通过抑制肿瘤细胞内NF-κB活性引起的;②抑制NF-κB活性的作用是通过抑制IκBα蛋白的磷酸化降解，导致IκBα蛋白累积，从而阻滞p65的核转位而实现的;③抑制NF-κB活性造成下游调控细胞内ROS水平的关键酶类FHC和MnSOD的表达减少，从而上调ROS水平，并进一步引发自噬反应。 结论: 二氢青蒿素诱导肿瘤细胞发生自噬主要是通过抑制NF-κB通路实现的，此过程与ROS的过度产生有关。

目录

声明

致谢

摘要

1．前言

2．实验材料和仪器

2．1 细胞株

2．2 药物与主要试剂

2．2．1 药物

2．2．2 细胞培养液

2．2．3 Western Blot相关试剂

2．2．4 流式细胞术相关试剂

2．2．5 其他相关试剂

2．3 主要仪器

2．4 各种试剂的配制

2．4．1 PBS配制(PH7．3)

2．4．2 细胞裂解液配制(Western Blot)

2．4．3 细胞裂解液配制(核质分离)

2．4．4 Loading Buffer配制(5×储备液)

2．4．5 A液(丙烯酰胺储存液)

2．4．6 EMSA相关试剂

3．实验方法

3．1 细胞株以及细胞培养

3．2 吖啶橙(AO)染色实验

3．3 细胞内活性氧水平的检测

3．4 免疫荧光检测

3．5 核质分离实验

3．6 肿瘤细胞凋亡的检测

3．7 透射电子显微镜检测

3．8 细胞内蛋白表达水平的检测

3．9 慢病毒包装及靶细胞转染

3．10 非放射性凝胶迁移实验(EMSA)

3．11 数据分析

4．实验结果

4．1 DHA诱导多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞发生自噬

4．2 DHA通过抑制多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞中NF-κB的激活导致自噬反应的发生

4．2．1 DHA抑制RPMI 8226细胞内NF-κB的活性

4．2．2 TNF-α逆转DHA抑制RPMI 8226细胞内NF-κB活性的作用

4．2．3 DHA抑制NF-κB活性与诱导自噬反应的时效变化分析

4．2．4 TNF-α逆转DHA诱导RPMI 8226细胞发生的自噬反应

4．2．5 过表达p65逆转DHA诱导RPMI 8226细胞内发生的自噬反应

4．3 DHA抑制NF-κB活性导致自噬也发生在早幼粒白血病NB4细胞，结肠癌HCT116细胞和宫颈癌Hela细胞中

4．4 DHA诱导肿瘤细胞发生自噬与ROS的过度产生有关

4．4．1 DHA上调RPMI 8226细胞内ROS的水平

4．4．2 DHA抑制RPMI 8226细胞内FHC和MnSOD的活性

4．4．3 TNF-α逆转DHA抑制RPMI 8226细胞内FHC和MnSOD活性的作用

4．4．4 TEMPO逆转DHA诱导肿瘤细胞发生的自噬反应

4．5 DHA诱导RPMI 8226细胞发生凋亡与NF-κB活性被抑制有关

5．讨论

6．总结

参考文献

综述 自噬在肿瘤发展及治疗中的作用

硕士期间学术成果

作者简历