柑橘木虱转录组分析及与柑橘黄龙病病原菌互作的初步研究

摘要

柑橘黄龙病(Huanglongbing，HLB)是柑橘产业上的一种毁灭性病害，其病原菌属于候选韧皮部杆菌属（Candidatus liberibacter），由媒介昆虫柑橘木虱（Diaphorina citri或Trioza erytreae）传播。迄今为止，对柑橘木虱的传菌机制和媒介昆虫-病原菌的互作关系知之甚少。本论文从以下几个方面对亚洲柑橘木虱和黄龙病病原菌亚洲种(Candidatus liberibacter asiaticus)开展研究，并得到了初步的结果:(1)发现海南和福建地理种群的亚洲柑橘木虱含有相同的优势内共生菌，即α-Proteobacteria,Wolbachia spp.、Candidatus Carsonella ruddii DC、Candidatus Profftella armatura;(2)亚洲柑橘木虱成虫在2年生蕉柑(Citrusreticulata cv.Tankan)病株上饲菌28天后带菌率达到最高;(3)亚洲柑橘木虱对3年生早橘（Citrus reticulata cv.Subcompressa）的初始传菌时间需53天左右，而整体性感染需75天左右;(4)制备了病原菌3个膜蛋白的4个多克隆抗体;(5)成功构建高质量的亚洲柑橘木虱cDNA酵母双杂交文库，并开展了媒介昆虫-病原菌互作蛋白的研究;(6)运用下一代高通量测序技术，我们获得亚洲柑橘木虱转录组数据，并对先天免疫途径、RNAi途径、P450s、CCEs、GSTs、OBPs、CSPs途径进行了分析;(7)对正常和携带病原菌的亚洲柑橘木虱成虫进行了表达谱分析，发现与病原菌感染显著相关的571个宿主基因，其中476个表达上调，95个表达下调。本研究结果为柑橘木虱传菌机制以及媒介昆虫-病原菌互作机制的探索提供了重要的理论基础。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 文献综述

1．1 柑橘黄龙病研究进展

1．1．1 危害与病原

1．1．2 病原检测

1．1．3 病原菌的分子生物学研究

1．1．4 柑橘与病原菌的互作研究

1．1．5 防治方法

1．2 亚洲柑橘木虱研究进展

1．2．1 生物学特征

1．2．2 内共生菌研究

1．2．3 传菌特性

1．2．4 防治方法

1．3 酵母双杂交技术

1．4 转录组研究

第2章 常用仪器、试剂和方法

2．1 常用仪器

2．2．1 培养基

2．2．2 SDS-PAGE试剂

2．2．3 Western blot试剂

2．2．4 抗生素配制

2．2．5 其他试剂

2．3 常用方法

2．3．1 SDS-PAGE

2．3．2 本研究所用引物

第3章 柑橘木虱内共生菌组成分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 内共生菌群落组成

3．2．2 优势内共生菌带菌率检测

3．3 讨论

第4章 柑橘木虱传菌能力分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 柑橘木虱成虫对黄龙病病原菌的获菌能力

4．2．2 带菌柑橘木虱对健康早橘的传菌能力

4．3 讨论

第5章 柑橘黄龙病病原菌膜蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 原核表达载体构建

5．2．2 诱导表达及蛋白纯化

5．3 讨论

第6章 酵母双杂交文库构建

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 ds cDNA的合成及纯化

6．2．2 柑橘木虱成虫cDNA文库转化效率、文库鉴定及文库滴度检测

6．3 讨论

第7章 酵母双杂交筛选互作蛋白

7．1 材料与方法

7．1．1 材料

7．1．2 方法

7．2 结果与分析

7．2．1 诱饵载体构建

7．2．2 重组载体转化酵母Y2H Gold并检测毒性和自激活

7．2．3 诱饵蛋白表达检测

7．2．4 互作蛋白筛选结果

7．3 讨论

第8章 柑橘木虱转录组和表达谱分析

8．1 材料和方法

8．1．1 材料

8．1．2 方法

8．2 结果与分析

8．2．1 数据组装结果

8．2．2 转录组数据分析

8．2．3 转录组数据部分基因比对分析

8．2．4 表达谱差异基因分析

8．3 讨论

总结

参考文献

在读期间发表的论文

致谢