家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)休眠孢子和发芽孢子转录组、蛋白质组定量差异分析及NbRBL蛋白功能的初步研究

摘要

微孢子虫(Microsporidia)是一类专性细胞内寄生的真菌生物，因其广泛的寄生性，特殊的生物进化分类地位与侵染机制而备受关注;目前已有超过187个属的1500多种微孢子虫被发现。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是一种最早发现的微孢子虫，它可以特异性侵染家蚕，并造成养蚕业严重的经济损失。家蚕微孢子虫可以利用发芽方式侵染宿主细胞;作为孢子侵染过程的第一步，发芽亦是家蚕微孢子虫由休眠状态向侵染状态转变的过程。目前对家蚕微孢子虫发芽过程有关分子生物学层面的变化及发芽对侵染过程影响的研究较少。为了研究家蚕微孢子虫发芽过程分子生物学机理，设计进行了相关实验并取得主要研究成果如下。
　　1、采用Illumina Hiseq2000测序平台，对家蚕微孢子虫休眠孢子(Non-germinated spore，NGS)和发芽孢子(Germinated spore，GS)进行转录组学测序与分析。获得NGS组和GS组共计64427013条高质量原始读长(reads);经过序列拼接，分别获得2756和2690个鉴定基因并进行了基因功能注释。通过对NGS组和GS组鉴定基因的差异表达分析，共获得66个显著差异基因(P＜0.05)，其中包括9个显著上调基因和57个显著下调基因。显著上调基因中包括蛋白磷酸酶PP2-A调节亚基，Western Blotting实验显示孢子发芽后其总蛋白磷酸化水平下降，由此推测蛋白磷酸化修饰在孢子发芽过程中发挥一定作用。显著下调基因主要包括糖代谢相关基因、胞壁蛋白基因及蓖麻毒素B凝集素基因等。GO(Gene ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物学通路分析进一步揭示了家蚕微孢子虫发芽过程中鉴定基因所体现的功能特点与涉及的重要代谢过程，其中KEGG分析结果显示显著差异基因主要富集在戊糖磷酸途径和氨基糖核糖代谢途径。本部分实验获得了孢子发芽过程中mRNA层面相关变化的实验数据，鉴定出一些重要相关功能基因并为进一步揭示家蚕微孢子虫发芽机理提供依据。
　　2、采用蛋白质组学无标记定量(Label-free quantitation)技术对家蚕微孢子虫休眠孢子(NGS)和发芽孢子(GS)进行蛋白质组学差异定量分析。通过LC-MS/MS及Maxquant软件分析，鉴定获得家蚕微孢子虫NGS组和GS组共计1136个蛋白，其中差异表达蛋白127个（P＜0.05），包括60个孢子发芽后显著上调蛋白和67个显著下调蛋白。其中胞壁蛋白30(SWP30)、胞壁蛋白4(SWP4)在孢子发芽后其蛋白含量显著下调;胞壁蛋白9(SWP9)在孢子发芽后显著上调。qRT-PCR实验验证了SWP4的变化结果。由此推测SWP4可能在孢子发芽及侵染过程中发挥作用。结合GO分析和KEGG生物学通路分析结果，发现糖酵解途径和磷酸戊糖途径在孢子发芽过程中发生明显变化;一些涉及基因转录和蛋白翻译过程的功能蛋白表现出显著的差异调节现象（P＜0.05）。由此推测家蚕微孢子虫在侵染和增殖过程中的能量代谢与蛋白合成可能是起始于孢子发芽阶段。通过本部分实验获得了家蚕微孢子虫发芽过程中蛋白质组差异变化的系统数据，鉴定出参与孢子发芽过程的相关功能蛋白并初步了解孢子发芽过程中物质能量代谢情况。本实验为进一步揭示微孢子虫发芽及侵染相关过程提供理论依据并为后续的代谢组学研究提供一定参考。
　　3、根据转录组学分析家蚕微孢子虫蓖麻毒素B凝集素基因(NbRBL，Ricin-B-lectin)在孢子发芽后显著下调的现象。运用软件对N6RBL蛋白序列进行分析，发现该蛋白等电点约为6.00，分子量约为57.7kDa;其在1到16位氨基酸为信号肽序列。亚细胞定位分析NbRBL蛋白被定位为分泌途径。糖基化位点分析NbRBL蛋白具有4个“N位”糖基化位点和21个“O位”糖基化位点，推测其具有与糖类物质结合的分子结构基础。进一步分析NbRBL基因在家蚕微孢子虫侵染BmN细胞后不同发育期表达特性发现，NbRBL基因在孢子的相对表达丰度，在30小时内均较低，42小时到96小时逐渐升高，在侵染后60小时达到最高。对NbRBL蛋白进行了基因克隆，原核表达及抗体制备。Western Blotting实验在家蚕微孢子虫总蛋白和发芽上清蛋白中都特异性检测到目的蛋白条带。利用间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)进行NbRBL蛋白细胞定位实验，发现特异性绿色荧光信号在胞内呈现弥散状分布。由NbRBL蛋白对家蚕微孢子虫粘附BmN细胞影响实验结果可知，NbRBL蛋白可以促进孢子粘附BmN细胞。由NbRBL对孢子侵染BmN细胞影响实验结果可知，anti-NbRBL孵育后的BmN细胞在接种N.bombycis孢子12小时后的不同时间点均比对照组BmN细胞增殖活性高，说明其受到孢子侵害的程度显著降低（P＜0.05）。由以上结果推测NbRBL蛋白在家蚕微孢子虫侵染BmN细胞过程中以促进粘附作用的方式帮助孢子的侵染行为，并最终增加孢子侵染效率。
　　综上所述，本研究利用生物信息学技术（转录组学差异分析、蛋白质组学定量分析）研究了家蚕微孢子虫在发芽过程中mRNA、蛋白层面的差异变化，结合生物信息学数据库之间互作分析与Western Blotting、qRT-PCR实验结果，推测去磷酸化作用和SWP4蛋白具有发芽功能性相关;涉及能量代谢的糖酵解途径和戊糖磷酸途径所发生的显著变化，是其为后续侵染和增殖过程进行的物资准备。N6RBL蛋白功能研究发现N6RBL蛋白促进了Nb孢子对BmN细胞的粘附进而在侵染过程中发挥作用。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第1章 文献综述

1．1 微孢子虫的研究意义

1．2 微孢子虫的生活史

1．3 微孢予虫的侵染方式研究

1．4 生物信息学方法对微孢子虫研究的帮助

1．5 蓖麻毒素及其B链凝集素生物学特性研究

1．5．1 蓖麻毒素的结构、功能及生物学特点

1．5．2 凝集素及Ricin-B-Lectin蛋白的功能研究

1．6 研究目的与意义

1．7 研究内容和技术路线

1．7．1 研究内容

1．7．2 技术路线

第2章 家蚕微孢子虫发芽孢子和休眠孢子转录组学差异分析

2．1 实验材料

2．1．1 生物材料

2．1．2 主要仪器与设备

2．1．3 主要试剂及配制

2．2 实验方法

2．2．1 家蚕微孢子虫繁殖和纯化

2．2．2 家蚕微孢子虫人工发芽处理

2．2．3 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组总RNA的提取

2．2．4 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组转录组测序及序列拼接

2．2．5 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组基因功能注释和转录组分析

2．2．7 实时荧光定量PCR验证

2．2．8 总蛋白的提取及Western Blotting验证

2．3 结果

2．3．1 家蚕微孢子虫休眠孢子和发芽孢子比较观察

2．3．2 家蚕微孢子虫转录组序列拼接和分析

2．3．3 基因注释和差异基因表达分析

2．3．4 差异表达基因聚类分析和功能富集性分析

2．3．5 家蚕微孢子虫发芽相关候选基因的预测

2．4 讨论

第3章 家蚕微孢子虫发芽孢子和休眠孢子蛋白质组学Label-free定量分析

3．1 实验材料

3．1．1 生物材料

3．1．2 主要仪器与设备

3．1．3 主要试剂及配制

3．2 实验方法

3．2．1 家蚕微孢子虫繁殖和纯化

3．2．2 家蚕微孢子虫人工发芽处理

3．2．3 家蚕微孢子虫NGS组和GS组总蛋白提取及FASP法酶解处理

3．2．4 家蚕微孢子虫NGS组和GS组总蛋白液相色谱串联质谱(LC-MS／MS)分析

3．2．5 数据的采集与分析

3．2．6 实时荧光定量PCR验证

3．2．7 Western Blotting检测

3．3 结果

3．3．1 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组的比较观察及总蛋白SDS-PAGE电泳检测

3．3．2 家蚕微孢子虫NGS和GS处理组的蛋白质组学Label-free定量分析

3．3．3 家蚕微孢子虫NGS和GS组鉴定蛋白的GO、KEGG和酶分类分析

3．4 讨论

第4章 NbRBL蛋白的表达、定位及其在家蚕微孢子虫侵染过程中的作用研究

4．1 实验材料

4．1．1 生物材料

4．1．2 主要仪器与设备

4．1．3 主要试剂及配制

4．2 实验方法

4．2．2 NbRBL基因在不同N．bombycis孢子发育过程的表达差异

4．2．3 表达质粒的构建

4．2．4 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE分析

4．2．5 Anti-NbRBL多克隆抗体的制备

4．2．6 Western blotting验证

4．2．7 间接免疫荧光试验(IFA)

4．2．8 NbRBL蛋白对N．bombycis孢子侵染BmN细胞的作用研究

4．3 结果

4．3．1 NbRBL蛋白序列分析

4．3．2 NbRBL基因在不同Nb孢子发育过程的表达差异

4．3．3 NbRBL基因的克隆、原核表达及抗体验证

4．3．4 激光共聚焦显微镜对NbRBL蛋白在家蚕微孢子虫中的定位

4．3．5 NbRBL蛋白在家蚕微孢子虫侵染过程中的作用

4．4 讨论

5．1 研究创新点

5．2 研究展望

参考文献

博士期间发表论文

附录