槌果藤有效部位提取物软膏在硬皮病动物模型中的抗纤维化作用研究

摘要

背景：
　　硬皮病是以局限性或弥漫性皮肤和内脏器官结缔组织的纤维化或硬化，最后发生萎缩为特点的疾病，可分为局限性和系统性两类。目前，我国硬皮病的发病率仅次于类风湿关节炎、红斑狼疮而居结缔组织病发病的第三位。硬皮病的确切病因及发病机理不明，目前尚无理想的治疗药物和方法，若病变累及心、肺、肾等重要脏器，预后不佳，可导致死亡。局限性硬皮病常见于额面、四肢等外露部位，严重影响美观，给患者带来不小的心理压力。因此，如何合理、有效治疗硬皮病显得十分重要。
　　硬皮病患者的成纤维细胞胶原合成增加是皮肤、内脏纤维硬化的主要原因之一、SSc成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ型胶原较正常增多，其中尤以Ⅰ型胶原增多显著。在此过程中，β-转化生长因子(TGF-β)是刺激成纤维细胞合成Ⅰ型胶原的重要因子，能刺激成纤维细胞生成结缔组织生长因子(CTGF)，后者可使成纤维细胞活化，合成胶原明显增加。CTGF是维持纤维化所不可缺少的因子，与TGF-β共同作用主导硬皮病的纤维化病理过程。
　　槌果藤（Capparis spinosa L.）又称刺山柑，具有祛风、除湿、通鼻窍、止淤消肿、止痛活血之功效;在新疆省内作为一种民族医药而被广泛应用。化学研究表明:槌果藤中含有挥发油、吲哚类、类黄酮类、谷甾醇类、葡萄糖异硫氰酸盐及一些结构新颖的化合物。药理学研究表明，槌果藤具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、降血脂血糖等作用。体外抗氧化实验发现:槌果藤花蕾的甲醇冷冻提取物(LECS)的抗氧化活性很强并可呈剂量依赖性的抑制坏血酸盐诱导的脂质过氧化。体内抗氧化实验研究:发现局部使用LECS能显著减轻UVB诱导的皮肤红斑。LECS可显著抑制IL-1β引起的炎症介质:一氧化氮、前列腺素E2及活性氧(ROS)的释放，因此，我们推测槌果藤醇提物具明显的抗皮肤纤维化、抗氧化作用。我们进行了一些体外实验研究，研究发现槌果藤乙醇提取物可显著抑制PSS患者Ⅰ型胶原产生，对正常人成纤维细胞的增殖、Ⅰ型胶原产生无影响，加药后成纤维细胞形态无明显改变，凋亡、死亡细胞无明显增多，提示槌果藤乙醇提取物具选择性抗皮肤纤维化作用，且其抗皮肤纤维化作用明显优于积雪甙，并筛选出了有效部位。进一步机理研究发现槌果藤乙醇提取物通过抑制CTGF表达来抑制胶原合成。
　　基于以上研究，我们设计了本实验，首先建立C3H小鼠硬皮病模型，在此基础上我们通过观察不同浓度槌果藤有效部位、积雪甙对小鼠模型皮肤厚度、胶原纤维组织化学指数、皮肤组织羟脯氨酸含量的影响，进一步从动物体内证实槌果藤有效部位的在体效果及其与积雪甙的在体疗效差异并筛选出最优浓度的槌果藤乙酸乙酯提取物。我们前期的课题通过提取工艺研究、配合药效学试验获得便于产业化生产的有效部位，并通过外用制剂工艺、质量标准、稳定性研究研制出质量稳定的槌果藤有效部位外用制剂，本研究进行槌果藤有效部位外用制剂的在体研究，为硬皮病的治疗开拓新的领域，为槌果藤的进一步开发应用提供依据。
　　目的：
　　通过槌果藤有效部位提取物软膏在硬皮病动物模型中的在体研究，证实其抗纤维化作用并筛选出软膏的最佳作用浓度。
　　材料和方法：
　　将C3H小鼠随机分成6组:正常对照组，空白对照组（下文中的博来霉素组），槌果藤软膏低、中、高剂量组及阳性对照组（下文中的积雪苷组），每组9只，均剃去背部中央区被毛，面积约1.5cm*2cm。
　　背部皮下注射250μg/ml博来霉素200μl，每日一次，并于注射第一天即在注射部位外敷空白基质、1％、2.5％、5％槌果藤软膏、2.5％积雪甙软膏各0.5g，每日2次，共3周;3周后取涂药局部皮肤，经HE、Masson三色染色，测定不同浓度槌果藤软膏组真皮厚度、胶原纤维组织化学指数、羟脯氨酸含量，并与空白基质组、阳性对照积雪苷软膏组比较，观察各浓度槌果藤软膏对皮肤纤维化指标（真皮厚度、胶原纤维组织化学指数、羟脯氨酸含量）抑制率的大小，对槌果藤软膏抗皮肤纤维化疗效进行在体验证，并确定最佳作用浓度。
　　统计方法
　　SPSS20.0软件进行分析，结果以(X)±S表示，进行正态性和方差齐性检验，多组间数据比较用单因素方差分析，两组间数据比较采用t检验，检验水准取0.05.
　　结果：
　　1.皮肤厚度博来霉素组注射区皮肤真皮厚度显著高于正常对照组(p＜0.01)，槌果藤1％、2.5％软膏组能显著抑制博来霉素诱导的真皮层增厚，尤其是2.5％组作用更为显著。槌果藤5％软膏组、积雪甙软膏组抑制作用显著弱于前两者。
　　2.真皮胶原纤维组织化学指数博来霉素组的小鼠注射区皮肤真皮层胶原纤维明显增多、增粗、排列紧密，其胶原纤维组织化学指数显著高于正常对照组，槌果藤1％，2.5％软膏组能明显抑制真皮层胶原沉积，该组小鼠的胶原纤维组织化学指数显著低于博来霉素组，积雪甙软膏对真皮层胶原沉积抑制作用显著弱于槌果藤软膏
　　3.皮肤组织羟脯氨酸含量博来霉素组小鼠皮肤羟脯氨酸含量显著增高，槌果藤软膏组小鼠皮肤羟脯氨酸含量显著低于博来霉素组，积雪甙软膏组小鼠皮肤羟脯氨酸含量介于槌果藤软膏组与博来霉素组之间。
　　结论：
　　槌果藤乙酸乙酯提取物软膏具有显著的抗皮肤纤维化作用，其中浓度为1％、2.5％疗效明显优于积雪甙霜，局部无刺激性。