槌果藤果实中有效部位的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种植物槌果藤果实中有效部位的制备方法，是将槌果藤实原料粉碎，用甲醇或乙醇提取，减压浓缩得到粗提物后用水混悬，低分子烷烃脱脂后以正丁醇萃取得到有效提取物，或将脱脂后的水相直接上大孔树脂柱以水醇系统洗脱得到有效提取物。本发明的槌果藤果实中有效部位可抑制系统性硬化症患者成纤维细胞的增殖、I型胶原及结缔组织生长因子mRNA表达、蛋白合成，对正常人成纤维细胞的增殖、胶原合成、CTGF表达无影响，可在制备治疗进行性系统性硬化症的药物中的应用。便于制成各种制剂，包括外用制剂和口服制剂。本发明方法设计合理，具有工艺过程简单、成本低、能耗低的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及植物医药技术领域，尤其涉及植物槌果藤果实有效部位(提取物)的制备方法及在制备治疗系统性硬化症药物中的应用。

背景技术

维吾尔中草药的使用已有悠久的历史，地处我国西北的新疆维吾尔自治区植物物种丰富，种类繁多，越来越多的野生物种已作为中药被广泛开发利用，槌果藤(Capparis spinosa L.)为白花菜科山柑种属植物，又称刺山柑，为半灌木状匍訇藤本，倒圆锥型、茎多分枝，长1～3cm，直径约5mm；叶片近革质。长1～5cm宽1～3.5cm，顶端近圆形或微凹，生有锐尖的硬刺，托叶退变后为刺状；花叶腋生，较大直径4～6cm，花梗长2～4cm，果实类球形或卵形。长2～4cm，果梗长2～4cm，果实成熟后裂开，内皮呈血红色。种子较多，肾形，黑褐色，有辣味，花期6个月.果期8个月。喜生于荒漠戈壁和低山坡石质沙土地处，新疆、西藏、以色列、土耳其、沙特阿拉伯、印度均有分布。

槌果藤又名野西瓜、老鼠瓜、刺山柑，维文名：开派、菠里科果。分布在新疆南北坡地，多用于治疗风湿、类风湿性关节炎等疾病，具祛风除湿、止淤消肿、止痛活血等多种功效。进行性系统性硬化症(PSS)是临床上目前难治病症之一，其主要特征是成纤维细胞合成细胞外基质(ECM)异常增多，导致真皮及内脏器官纤维化和硬化、功能障碍。近年来在新疆作为维吾尔族药曾用槌果藤鲜果泥膏及粗提物外敷治疗局限性硬皮病及瘢痕疙瘩的报道，但人们多是对槌果藤进行简单加工使用，直接外用、内服均有一定的刺激作用。目前未见有关药用部位提取、药理学及作用机制方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种植物槌果藤果实中有效部位的制备方法，该方法是将槌果藤实原料粉碎，用甲醇或乙醇提取，减压浓缩得到粗提物后用水混悬，低分子烷烃脱脂后以正丁醇萃取得到有效提取物，或将脱脂后的水相直接上大孔树脂柱以水醇系统洗脱得到有效提取物，该方法脱脂后采用正丁醇萃取或大孔树脂柱层析一步即可获得有效部位，具体通过以下步骤实现：

1.取槌果藤果实粉碎成粗粉，用8倍量或以上的甲醇或乙醇提取2～3次，甲醇、乙醇的浓度为50～100％，提取方式采用加热回流或渗漉；

2.将提取液合并后减压浓缩，除去甲醇或乙醇，浓缩液或浓缩得到的浸膏加水混悬，用低分子烷烃萃取脱脂完全后，再用正丁醇反复萃取至近无色，合并正丁醇萃取液，减压浓缩干燥即得，得率≈1.5％。所述的低分子烷烃类为石油醚、正己烷、正庚烷或环己烷；

3.萃取后的水相上大孔树脂柱，水洗脱3个体积后再用70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，喷雾干燥得到干燥粉末，得率≈1.5％。采用的大孔树脂包括DM301、NKA-9型、AB-8、D101、DM130、DM-18、D312型弱极性或中极性大孔树脂。

本发明的另一个目的是提供槌果藤果实中有效部位在制备治疗进行性系统性硬化症的药物中的应用。所述有效部位可以加入药剂学允许的赋形剂制备成药物制剂，制剂形式有外用制剂和口服制剂，外用制剂包括涂膜剂、软膏、硬膏、霜剂、凝胶，口服剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂。

本发明的有益之处是：(1)本发明对原料药材中的有效成分进行了充分的提炼、浓缩，得到的有效部位仅占药材重量的1.5％左右，优于用鲜果泥膏及粗提物入药，便于制成各种制剂。(2)用本发明方法获得的有效部位，具有显著的药理作用，可抑制系统性硬化症患者成纤维细胞的增殖、I型胶原及结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达、蛋白合成，对正常人成纤维细胞的增殖、胶原合成、CTGF表达无影响。药理实验证实对小鼠模型皮肤纤维化具有显著的抑制作用。(3)获得的有效部位除外用制剂外，可以制成制成口服制剂，外敷治疗局限性硬皮病疗效显著，内服治疗内脏器官纤维化和硬化、功能障碍等。(4)本发明方法设计合理，具有工艺过程简单、成本低、能耗低的特点。

附图说明

图1为槌果藤药用部位对PSS患者细胞形态的影响。

图2为槌果藤有效部位对正常人及PSS患者I型胶原mRNA的影响。

图3为槌果藤有效部位对成纤维细胞胶原蛋白含量的影响。

图4为槌果藤有效位对正常人及PSS患者CTGFmRNA的影响。

图5为槌果藤有效部位对成纤维细胞CTGF蛋白表达的影响。

图6为C3H小鼠各不同处理组胶原Masson染色。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。

实施例1槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加1600ml乙醇，回流提取2小时，过滤后滤渣再加1000ml乙醇回流1小时，合并两次滤液，减压回收乙醇，得到浸膏。将此浸膏用200ml水混悬后以石油醚萃取三遍脱脂，再用正丁醇萃取三遍至萃取层近无色，合并正丁醇萃取液，浓缩成浸膏得3.08g药用部位。

实施例2槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加50％乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收乙醇完全，剩余水相以正己烷萃取三遍脱脂，再上AB-8大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得2.92g药用部位。

实施例3槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加1600ml甲醇，回流提取2小时，过滤后滤渣再加1000ml甲醇回流1小时，合并两次滤液，减压回收甲醇，得到浸膏。将此浸膏用200ml水混悬后以环己烷萃取三遍脱脂，再用正丁醇萃取三遍至萃取层近无色，合并正丁醇萃取液，浓缩成浸膏得3.06g药用部位。

实施例4槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加50％甲醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收甲醇完全，剩余水相以正庚烷萃取三遍脱脂，再上D101大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得2.98g药用部位。

实施例5槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加70％乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收乙醇完全，剩余水相以正己烷萃取三遍脱脂，再上DM301大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得3.12g药用部位。

实施例6槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加80％甲醇1600ml回流提取2小时，过滤后滤渣再加80％甲醇1000ml回流1小时，合并两次滤液，减压回收甲醇完全，剩余水相用石油醚萃取三遍脱脂，再上NKA-9大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得2.89g药用部位。

实施例7槌果藤有效部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加70％乙醇1600ml回流提取2小时，过滤后滤渣再加70％甲醇1000ml回流1小时，合并两次滤液，减压回收乙醇完全，剩余水相用石油醚萃取三遍脱脂，再上DM-18大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得3.10g药用部位。

实施例8槌果藤有效药用部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加甲醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收甲醇完全，剩余水相以正己烷萃取三遍脱脂，再上DM130大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得2.86g药用部位。

实施例9槌果藤有效药用部位的制备

取槌果藤实200g左右粉碎，加乙醇渗漉提取一周，渗漉液合并后减压回收甲醇完全，剩余水相以石油醚萃取三遍脱脂，再上D D312大孔树脂，以水洗脱3个柱体积后，以70％乙醇洗脱至流出液近无色，收集此部分洗脱液，减压浓缩回收乙醇完全后喷雾干燥，得2.96g药用部位。

实施例10涂膜剂制备

取聚乙烯醇(PVA)12450g，加入到350ml蒸馏水中浸泡溶涨后水浴加热，过滤。另取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位50g，与10g甘油、30g苯甲酸一起加入至500ml乙醇中在搅拌下至药物基本溶解，搅拌均匀后缓缓加入聚乙烯醇液中，随加随搅拌，搅匀后滤过即得。

实施例11软膏剂制备

取硬脂酸100g在水浴上熔化，加入羊毛脂20g、白凡士林120g并水浴加热至80℃，另将甘油120g及蒸馏水500ml加热至90℃，再加入十二烷基硫酸钠10g和羟苯乙酯1g溶解为水相，然后慢慢将水相倒入油相中，边加边搅拌直至冷凝，即得乳剂型基质，取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位50g加入到上述基质中，搅拌均匀即得。

实施例12硬膏剂制备

取生胶洗净，切成适宜大小的条块，在炼胶机中塑炼成网状胶片，浸入适量的溶剂汽油中，浸泡至完全溶涨成凝胶状，移入打膏桶内搅拌3-4小时，依次加入凡士林、羊毛脂、松香、氧化锌等制成基质，再加入上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位适量，继续搅拌3小时，待已成均匀膏浆时，以七号筛滤过，经涂布、切割、加衬、包装即得。

实施例13凝胶剂制备

取卡波姆940适量撒入100ml纯水中，搅拌使溶涨，加入亚硫酸钠2g与丙二醇100ml搅拌溶解，搅拌下滴加三乙醇胺，制成凝胶基质，另取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位20g与羟苯乙酯1g溶解于200ml乙醇中，搅拌下加入凝胶基质中，搅匀即得。

实施例14片剂制备

取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位50g，粉碎后过80目筛，与淀粉100g混匀，加10％淀粉浆10g制成软材加入硬脂酸镁1g，干淀粉10g混匀后压制成1000片，即得。每片含槌果藤药用部位50mg。

实施例15胶囊剂制备

取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位50g，粉碎后过80目筛，加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，套入1号空心胶囊中。共装1000粒，每粒胶囊含槌果藤药用部位50mg。

实施例16丸剂制备

取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位50g，粉碎后过80目筛，适量蜂蜜作黏合剂泛制成丸。

实施例17颗粒剂制备

取上述1～9任一实施例方法获得的槌果藤药用部位50g，粉碎后过80目筛，加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，分装，密封，包装即得。

实施例18

用本发明方法获得的这种有效部位，具有显著的药理作用，可抑制系统性硬化症患者成纤维细胞的增殖、I型胶原及结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达、蛋白合成，对正常人成纤维细胞的增殖、胶原合成、CTGF表达无影响。药理实验证实对小鼠模型皮肤纤维化具有显著的抑制作用。

1.对系统性硬化症患者成纤维细胞增殖的影响

三株PSS患者成纤维细胞分别取自三例病程短于2年的PSS患者新发皮损的活动性边缘，三株正常对照的成纤维细胞取自三位年龄、性别、取材部位与PSS患者匹配的正常人皮肤。用含10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃、5％CO2孵育箱内培养，待90％融合后用0.25％胰酶进行传代，3～6代细胞用于实验。细胞在药物处理前均予无血清培养基同步化处理24h。同步化处理后，更换含槌果藤药用部位的培养基，根据预试验结果，终质量浓度设为：0，5，15，30μg/ml，每个浓度设6个复孔，培养72h后，每孔加入10μl 5mg/ml MTT，继续孵育4h，弃培养基，每孔加100μl DMSO待紫色结晶充分溶解，混匀后于酶标仪570nm处测得吸光度值(A)，抑制率＝(A对照-A用药)/A对照×100％，实验重复三遍。用MTT比色法测定细胞增殖活性，结果发现：槌果藤药用部位作用72h对体外培养的正常人成纤维细胞的增殖无影响，浓度5μg/ml起可显著抑制PSS患者成纤维细胞的增殖，以30μg/ml的抑制作用最明显。5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml的抑制率分别为：15.5％、28.2％、35.0％。在倒置显微镜下观察加药后的成纤维细胞胞体饱满，呈梭形，见多个细长突起，平行极性排列，呈漩涡状走向，与未加药的细胞形态无明显差异。参见图1，图中：A.未加药，B.30μg/ml槌果藤有效部位。

2.槌果藤药用部位对成纤维细胞I型胶原mRNA表达的影响

PSS患者及正常人成纤维细胞均以1×10⁶/dish密度接种于10cm培养皿中，待细胞融合时，用含槌果藤药用部位30μg/ml的培养基培养6h，12h，24h，48h，每个时间点设含0.1％DMSO的培养基孵育的细胞为空白对照。用Trizol、氯仿、异丙醇抽提细胞总RNA，取2μgRNA作为模板按试剂盒说明进行逆转录得DNA模板，PCR扩增，PCR反应体系50μl，I型胶原引物序列上游引物：5’-TCC AAA GGA GAG AGC GGT AA-3’，下游引物：5’-GAC CAG GGA GACCAA ACT CA-3’。扩增参数：95℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸45秒，30个循环。β-actin上游引物5’-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GA-3’，下游引物：5’-ATG GAT GAT GAT ATC GCC GC-3’。扩增参数：95℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸1分钟，25个循环。1.8％琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析灰度值，以I型胶原与β-actin灰度值的比值表示I型胶原的相对表达量。实验重复三遍。结果发现该药用部位对正常人成纤维细胞的I型胶原mRNA表达无影响，加药12h起可抑制PSS患者成纤维细胞的I型胶原mRNA表达，并呈时间依赖性，加药12h、24h、48h的抑制率分别为34.5％、45.3％、58.6％。结果参见图2。

3.槌果藤药用部位对成纤维细胞I型胶原蛋白含量的影响

将细胞按1×10⁶/dish密度接种于10cm培养皿中，用含槌果藤药用部位0，5，15，30μg/ml的培养基培养72h，收集、裂解细胞，提取细胞蛋白，BCA蛋白定量。每样本取20μg蛋白，行8％SDS-PAGE胶电泳，恒流250mA转PVDF膜2h，5％脱脂奶粉封闭2h，加1∶800羊抗人I型胶原抗体4℃过夜，TBST洗涤3次，HRP标记兔抗羊二抗1∶1000室温孵育2h，TBST洗涤3次，加ECL 5min，曝光，洗片。同时测定β-actin，结果以胶原与β-actin灰度值的比值表示。实验重复三遍。结果表明槌果藤药用部位作用72h对正常成纤维细胞I型胶原蛋白合成无抑制作用，从浓度5μg/ml起可显著抑制PSS患者成纤维细胞的I型胶原蛋白合成，并呈浓度依赖性，加药浓度5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml的抑制率分别为：16.5％、39.2％、47.4％。结果参见图3。

4.槌果藤药用部位对成纤维细胞CTGFmRNA表达的影响

细胞处理、RNA提取及RT-PCR扩增方法参照2，CTGF引物序列参照文献，上游引物：5’-GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG G-3’，下游引物：5’-ATG TCT CCG TAC ATC TTC CTG TAG T-3’扩增参数：95℃变性30秒，62℃退火20秒，72℃延伸45秒，25个循环。实验重复三遍。

结果发现该药用部位对正常人成纤维细胞的CTGFmRNA表达无影响，加药6h起可抑制PSS患者成纤维细胞的I型胶原mRNA表达，加药6h、12h、24h、48h的抑制率分别为45.5％、53.3％、60.2％、42.0％。参见图4。

5.槌果藤药用部位对成纤维细胞CTGF蛋白表达的影响

细胞处理、蛋白提取及westernblot方法同3，羊抗人CTGF一抗1∶1000稀释，实验重复三遍。结果发现槌果藤药用部位作用48h可显著抑制PSS患者成纤维细胞的CTGF蛋白表达，并呈浓度依赖性，加药浓度5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml的抑制率分别为：12.6％、30.0％、40.9％，参见图5。

6.槌果藤对小鼠模型皮肤纤维化的阻断、抑制作用

硬皮病小鼠模型建立及药物处理将C3H小鼠随机分成3组，每组6只，均剃去背部中央区被毛。博来霉素组：背部皮下注射250μg/ml博来霉素200μl，每日一次，共3周；槌果藤药用部位组：同上方法注射博来霉素并于注射第一天即在注射部位外敷槌果藤药用部位乳膏0.5g，用塑料薄膜封包1小时，每日2次，共3周；PBS组：同一部位注射PBS200μl，每日1次，共3周。

注射及擦药结束后第二天，以眼球摘除法处死小鼠，取下背部靶部位皮肤，进行皮肤厚度、胶原纤维组织化学指数及羟脯氨酸含量测定，结果表明：

1)皮肤厚度博来霉素组注射区皮肤真皮厚度显著高于PBS组(p＜0.01)，槌果藤药用部位组能显著抑制博来霉素诱导的真皮层增厚。(参见表1，图6)

2)胶原纤维组织化学指数博来霉素组的小鼠注射区皮肤真皮层胶原纤维明显增多、增粗、排列紧密，其胶原纤维组织化学指数显著高于PBS组，槌果藤药用部位组能明显抑制真皮层胶原沉积，小鼠的胶原纤维组织化学指数显著低于博来霉素组。参见表1和图6，图6中A.PBS组，B.博来霉素组，C.槌果藤药用部位组。

3)皮肤组织羟脯氨酸含量博来霉素组小鼠皮肤羟脯氨酸含量显著增高，槌果藤药用部位组小鼠皮肤羟脯氨酸含量显著低于博来霉素组。(表1)

表1：槌果藤对硬皮病小鼠模型皮肤纤维化的影响

  组别  例  数  真皮厚度(μm)  胶原纤维化学指数  羟脯氨酸含量  (μg/6mm皮肤)  PBS组  博来霉素组  槌果藤药用部位组  6  6  6  117.13±9.54  211.38±10.75*  138.58±11.65**  48052.03±6800.64  117840.1±10018.27*  67236.45±10238.93**  19.35±2.06  33.50±3.45*  21.90±1.19**

注：与PBS组比较*P＜0.01；与博来霉素组比较**P＜0.01。