TRAF2 siRNA对增加口腔鳞癌放疗敏感性作用的研究

摘要

目的:
　　口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一。对于口腔鳞癌的治疗，目前主要以外科手术为主，协同放化疗或生物治疗的综合治疗。虽综合治疗已取得了一定效果，但对于中晚期口腔鳞癌患者，疗效仍不理想，总体生存率并无显著提高。相对于放、化疗等传统的肿瘤治疗手段，靶向治疗具有特异性强、用药量低、毒副作用小、人体耐受性好等优点。近年来，已有多种靶向治疗应用于临床，并取得良好效果。但由于肿瘤细胞生长受多种途径调控的特性，针对单一途径的靶向治疗长期预后受限，肿瘤易复发，因此，发现新的靶向于肿瘤组织或者细胞的分子，尤其是参与多条信号通路的关键分子，在肿瘤治疗和早期诊断上有非常重要的临床意义。肿瘤坏死受体相关因子2(Tumornecrosis factor receptor-associated factor2，TRAF2)是一类重要的胞浆衔接蛋白，它在多种恶性肿瘤细胞存在着高表达，也是该家族中唯一的介导多条凋亡保护信号通路中的蛋白，是调节细胞内、外途径凋亡的关键因子，但它在口腔颌面部恶性肿瘤，尤其口腔鳞癌中的特异性表达及其生物学功能尚未见文献报道。本文第一部分研究TRAF2在口腔恶性肿瘤特别是鳞癌中的表达及其与患者临床病理指标间相关性的研究，第二部份探讨了TRAF2 siRNA转染（TRAF2基因沉默）对舌鳞癌细胞系CAL27生物学行为的影响，第三部分和第四部分研究了TRAF2 siRNA转染结合放射治疗对体外培养的CAL27细胞及口腔鳞癌动物模型体内肿瘤的生物学行为的影响。本研究以口腔鳞癌临床标本、细胞系培养、动物模型等一系列实验对象，系统地进行了体内、外实验研究，拟确定TRAF2为口腔鳞癌靶向治疗的关键位点，确定TRAF2基因沉默（TRAF2 siRNA）可促进放疗增敏作用，从而为口腔鳞癌临床治疗提供一种新治疗思路及其实验依据。
　　方法:
　　1.通过免疫组织化学的方法检测57例口腔恶性肿瘤组织标本（50例鳞癌组织和7例其它恶性肿瘤）和30例癌旁2cm以上正常粘膜组织中TRAF2的表达，采用免疫组织化学得分和平均光密度值来确定TRAF2在组织中的反应强度，统计分析TRAF2表达与肿瘤大小、TNM临床分期、病理分级及淋巴结转移等临床病理指标的相关性。
　　2.将TRAF2 siRNA转染舌鳞癌细胞系CAL27，Western Blot法鉴定siRNA转染后的TRAF2蛋白表达下调（基因沉默）效果以及NF-κB信号通路中TRAF2下游蛋白RIP1表达的改变。通过CCK8细胞活力检测技术、流式细胞术（AnnexinⅤ/PI双染法）等方法检测TRAF2 siRNA转染对口腔鳞癌细胞增殖、凋亡、细胞周期分布等生物学行为的影响。
　　3.采用不同剂量(2Gy，4Gy，6Gy，8Gy)的X射线照射TRAF2 siRNA转染、Control siRNA转染和未转染的舌鳞癌细胞系CAL27，通过CCK8细胞活力检测技术、流式细胞术（AnnexinⅤ/PI双染法，PI单染法）等方法验证TRAF2 siRNA对细胞放疗增敏的效果，检测不同放射剂量对TRAF2 siRNA转染的CAL27细胞增殖、凋亡、周期等生物学行为的影响，并筛选出适宜的放射剂量用于更深入的动物体内实验。
　　4.采用悬液注射法建立CAL27舌癌裸鼠动物模型，通过EntransterTM-in vivo体内转染试剂将TRAF2 siRNA直接转染已建模的实体肿瘤，比较在6Gy放射剂量下TRAF2 siRNA转染组、未转染组和未经放射组三组裸鼠肿瘤体积和瘤重的变化。
　　结果:
　　1.在50例口腔鳞癌组织中，TRAF2表达阳性46例，其阳性表达率为92％，其中26例表达弱阳性（占52％），20例表达阳性（占40％）。TRAF2在口腔其他恶性肿瘤中表达呈100％阳性，但在正常口腔粘膜组织中低表达。本实验数据表明TRAF2的表达程度与口腔癌的病理分级、淋巴转移有关(P＜0.05)，但尚不能证明TRAF2与肿瘤大小、TNM临床分期的生物学行为有关(P＞0.05)。
　　2.TRAF2 siRNA可有效转染舌鳞癌细胞系CAL27，转染后TRAF2蛋白表达明显下降，并出现NF-κB途径中相应下游蛋白RIP的表达下降。通过对TRAF2 siRNA转染组、对照转染组和空白组细胞活力和早期凋亡率的进一步对比中发现，TRAF2siRNA转染后细胞增殖活性没有明显改变，但细胞早期凋亡率有一定增高(P＜0.05)。
　　3.比较不同放射剂量下TRAF2 siRNA转染组、对照转染组和空白组细胞的细胞活力、早期凋亡率和细胞周期分布，发现在放射下，三组细胞均出现了细胞活力和早期凋亡率的改变以及G2/M期阻滞作用，其中TRAF2 siRNA转染组细胞改变最为明显。当放射剂量在6Gy时，转染组细胞活力下降和早期凋亡率升高以及G2/M期细胞比例增高最为最明显，组间有统计学差异(P＜0.05)。
　　4.成功建立CAL27舌癌裸鼠动物模型，比较未放射组、放射组、转染TRAF2siRNA+放射组三组裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量，结果显示，放射组比未放射组裸鼠肿瘤体积和重量明显减小，而TRAF2 siRNA转染+放射组裸鼠肿瘤体积和重量减小更加明显，肿瘤抑制率达到88.2％，较放射组提高了18.1％。
　　结论:
　　1.TRAF2在口腔鳞癌组织中呈特异性的高表达，而在口腔正常组织低表达。
　　2.TRAF2 siRNA转染可使CAL27舌鳞癌细胞TRAF2蛋白表达有效沉默（较congtrol组下降47％）。转染后的肿瘤细胞增殖能力没有明显改变，但肿瘤细胞的凋亡率随TRAF2的表达下降而升高。
　　3.在不同剂量的X射线放射下，TRAF2 siRNA转染的CAL27细胞，出现G2/M期阻滞和G2/M期细胞比例的上调，并出现细胞凋亡率的增加和细胞增殖抑制，细胞活力曲线下降，具有明显的放射增敏作用。
　　4.TRAF2 siRNA可提高舌鳞癌裸鼠模型体内肿瘤的放射敏感性，与单纯放疗相比较，TRAF2 siRNA转染联合放疗可更有效地减小肿瘤体积和重量，提高肿瘤抑制率。