几丁质对海洋酵母Rhodosporidium paludigenum果实采后病害防治效力的影响及相关机理研究

摘要

由真菌病害引起的果实采后腐烂变质是导致水果大量损失的主要原因之一，利用拮抗酵母生物防治的方法近几十年来已经取得了一定的进展，被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一。海洋酵母Rhodosporidium paludigenum是本实验室从中国东海海域分离筛选到的一株生防酵母，对多种果实采后病害具有显著的生物防治效力。但是目前拮抗酵母单独使用时的效力与化学杀菌剂相比仍有较大差距，因此如何有效提高其防治效果是影响商业化推广应用的关键性因素。
　　几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1，4糖苷键连接而成的长链高分子多糖，已被美国环境保护署和食品药品管理局批准作为生物农药和食品添加剂使用，其开发利用深受国内外关注。本论文主要研究了几丁质对海洋酵母R.paludigenum拮抗效力的影响，探讨了影响拮抗效力的因素，从体外试验、体内试验、酵母生理、果实生理等多个角度分析了相关机理，并通过同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)系统分析了几丁质对海洋酵母R.paludigenum蛋白表达的影响。
　　本论文主要获得了以下研究结果:
　　(1)在NYDB培养基中添加几丁质可以提高海洋酵母R.paludigenum对多种果实的多种采后病原真菌的防治效力，与其他几种诱导培养物质（海藻糖、葡聚糖、壳聚糖）相比，几丁质对R.paludigenum拮抗效力的提高作用最为显著。
　　(2)几丁质诱导培养的最优添加浓度为1.0％(w/v)，最优诱导培养时间为36小时，在最优条件诱导培养后，在各个使用浓度上，海洋酵母R.paludigenum的拮抗效力显著增强，且在冷藏条件和采前处理条件下，几丁质对海洋酵母Rpaludigenum生防效力的提高作用依然显著。
　　(3)几丁质与氯化钠单独诱导培养均能在一定程度上增强海洋酵母Rpaludigenum的拮抗效力，但是这两者之间不存在协同增效作用，且在结合诱导培养中起主导作用的可能是几丁质。
　　(4)几丁质诱导培养提高海洋酵母R.paludigenum生防效力的机理可能包括以下几方面:①几丁质诱导培养能促进海洋酵母R.paludigenum在果实体内的生长，且在果实表面的定殖数量也较高;②几丁质能增强海洋酵母R.paludigenum对果实抗性的诱导作用，这种作用可能与激发果实抗性相关酶、抑制脂质过氧化等有关;③几丁质诱导培养后，海洋酵母R.paludigenum抗氧化相关酶活性显著提高，脂质过氧化产物积累显著降低;④几丁质诱导培养能激发海洋酵母R.paludigenum分泌包括几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶在内的胞外水解酶。
　　(5)利用iTRAQ定量蛋白质组技术分析了几丁质诱导培养对海洋酵母R.paludigenum蛋白表达的影响，结果表明:①共获得几丁质诱导培养前后R.paludigenum的差异表达蛋白587个，其中上调表达蛋白327个，下调表达蛋白260个;②核糖体蛋白大部分上调表达，主要为40S小亚基核糖体蛋白和60S大亚基核糖体蛋白;③与糖酵解途径和磷酸戊糖途径相关的蛋白上调表达，其中糖酵解途径中的关键酶己糖激酶和磷酸戊糖途径中的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶上调表达;④酵母氨基酸代谢的多个途径的蛋白表达发生了显著的变化，其中催化谷氨酸代谢形成脯氨酸的吡咯啉-5-羧酸脱氢酶显著上调表达;⑤包括过氧化氢酶A、细胞色素C过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物酶5、线粒体过氧化物酶6在内的9个抗氧化相关蛋白显著上调表达;⑥海藻糖合成相关的两个蛋白海藻糖-6-磷酸磷酸酶(trehalose6-P phosphatase)和海藻糖合成酶(trehalose synthase)显著上调表达;⑦1个热激蛋白/分子伴侣和1个热激转录因子显著上调表达，而1个Hsp70家族的热激蛋白则下调表达。
　　综上所述，在普通培养基中添加几丁质培养是能够提高海洋生防酵母R.paludigenum拮抗效力的有效方法，且通过常规方法和iTRAQ定量蛋白质组技术对相关生物学机理进行了系统分析，但还需要进一步研究阐释。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

英文缩写词中英文对照表

第一章 文献综述

1 水果采后病害防治现状

1．1 我国水果产业概况

1．2 水果采后真菌性病害

1．3 化学杀菌剂的优劣性

2 采后拮抗酵母研究进展

2．1 生物防治概述

2．2 采后拮抗酵母作用机理及其优点

2．3 提高拮抗酵母生防效力的方法和途径

3 生理调控提高拮抗酵母生防效力的研究进展

4 几丁质提高生防酵母拮抗效力的可行性

4．1 几丁质的结构和性质

4．2 几丁质的应用进展

4．3 几丁质提高生防酵母拮抗效力的可行性

4．4 几丁质提高拮抗微生物效力的研究

5 海洋酵母及其特点

5．1 海洋酵母概述及其特点

5．2 海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum拮抗效力及其特点

6 论文立题背景和意义

7 论文主要研究内容

第二章 几丁质对海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum拮抗效力的影响

第一节 几丁质对海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum控制不同果实病害的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 影响几丁质提高海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum拮抗效力的因素

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三节 几丁质与氯化钠结合培养对海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum拮抗效力的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 几丁质对果实和海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum生理的影响

第一节 几丁质诱导培养海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum对果实生理的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第二节 几丁质诱导培养对海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum生理的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第四章 几丁质对海洋生防酵母Rhodosporidium paludigenum蛋白表达的影响

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要仪器

2．2 试验材料、微生物与试剂

2．3 酵母诱导培养

2．4 iTRAQ定量蛋白质组实验操作流程

2．5 生物信息分析

3 结果与分析

3．1 海洋酵母R．paludigenum蛋白样品浓度测定及电泳结果

3．2 海洋酵母R．paludigenum蛋白鉴定结果

3．3 几丁质诱导培养前后海洋酵母R．paludigenum差异蛋白分析

4 讨论

第五章 本论文主要研究成果与后续研究展望

1 本论文主要研究结果

2 本论文的主要创新点

3 本论文后续研究展望

参考文献

作者简介

攻读博士期间主要科研成果

攻读博士期间主要奖项与荣誉