代谢工程改造酿酒酵母生物合成类胡萝卜素的研究

摘要

酿酒酵母是异源合成天然产物的重要宿主，但是在酿酒酵母中构建遗传稳定性好、基因表达可控的代谢途径仍然是代谢工程和合成生物学中的一大挑战。类胡萝卜素是具有抗氧化、防癌等功效的高附加值四萜类化合物。本文以开发代谢途径组装工具和策略为基础，结合代谢途径基因的表达调控，关键酶的定向进化等技术，对在酿酒酵母中构建高效的β-胡萝卜素和番茄红素生物合成途径进行了研究。
　　首先，从红法夫酵母cDNA中克隆了CrtE、Crt YB和CrtI三个基因，并将其按照传统的代谢途径方法在高拷贝的2μ附着型载体上进行了表达，获得了能合成β-胡萝卜素的重组菌株。由于该方法构建的菌株遗传不稳定，我们探索了其它策略，以实现代谢途径在基因组中的组装。
　　为了能将长的代谢途径有效地整合进酿酒酵母的基因组中，研究中构建了一套基于Cre/loxP重组系统的pMRI载体。经过测试，该套载体在循环使用时其选择标记区段lox P-KanMX-p BR322ori-loxP的pop-out效率达到70％，可以有效地用于代谢途径中相关基因的分步整合。基于所构建的载体工具，我们提出了代谢途径的分散式整合策略（Decentralized assembly）。同时为了使所构建的代谢途径中的基因表达可以受到外部条件控制，对酿酒酵母的GAL调控系统进行了改造，敲除了其中的GAL80基因，使GAL启动子所控制的基因表达可以受到外界葡萄糖浓度的调控。将两个拷贝的Crt YB和CrtI以及一个拷贝的CrtE和tHMG1，共6个ORF整合到酵母基因组中，并利用改造后的GAL调控系统对上述基因的表达进行控制，所得到的重组酿酒酵母菌株在摇瓶中的总类胡萝卜素产量达到了11 mg/g DCW(72.57mg/L)。通过20代的连续培养，证实了所构建代谢途径的遗传稳定性。
　　代谢前体物质的平衡利用是提高目标代谢物产量的关键因素。通过建立以类胡萝卜素颜色为指示的启动子强度表征系统，对一系列不同强度的启动子进行了筛选，其中强启动子被用于基因的过表达，而弱启动子则用于旁侧代谢途径的下调。结合组成型和诱导型β-胡萝卜素合成途径以及HXT1启动子控制的角鲨烯合成途径，对节点物质FPP的上游、下游和旁侧基因的表达进行了顺序控制。通过上述策略构建出了总类胡萝卜素产量高达20.79mg/g DCW(1156mg/L)的酿酒酵母菌株。该菌株与实验中最初构建的仅仅整合了Crt YB和CrtI基因的菌株相比，其单位细胞干重中总类胡萝卜素的产量提高了约700倍。同时，实时荧光定量PCR证实了在发酵过程中代谢途径中各基因的表达是以预期的顺序进行。
　　此外，为了构建能高效合成番茄红素的菌株，研究中采用定向进化的方法对合成途径中的关键酶进行了逐个改造。其中，通过对CrtYB基因编码的双功能酶的环化酶功能区域进行定向进化，得到了环化酶失活，但八氢番茄红素合酶功能域保留完好的突变体CrtYB11M;对CrtE基因定向进化得到了表达量提高的正突变CrtE03M。与野生型相比，突变体CrtE03M在基因组上的表达使得番茄红素的产量提高了1.16倍。然后，通过调节不同Crt基因的拷贝数，考察对菌株生物量和番茄红素积累产生的影响，最后构建出了YXWPD-14菌株。该菌株在无机盐发酵培养基中发酵120h后，单位发酵体积的总类胡萝卜素产量达到了1.6g/L，细胞内的类胡萝卜素干重含量为24.4mg/g DCW，HPLC分析表明其中90％的类胡萝卜素为番茄红素。

目录

声明

致谢

摘要

缩写词表

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 类胡萝卜素的应用及市场

1．2．1 类胡萝卜素简介

1．2．2 类胡萝卜素的用途

1．2．3 类胡萝卜素的市场价值

1．3 类胡萝卜素的合成

1．3．1 类胡萝卜素的化学法合成

1．3．2 类胡萝卜素的生物合成途径

1．3．3 生物法合成类胡萝卜素研究进展

1．3．4 类胡萝卜素在异源宿主中的合成

1．4 酶分子定向进化在类胡萝卜素生物合成中的应用

1．4．1 定向进化用于新类胡萝卜素分子的合成

1．4．2 定向进化在提高类胡萝卜素产量上的应用

1．5 酿酒酵母中外源代谢途径的组装和表达调控

1．5．1 基于附着型载体的方法

1．5．2 基于YIP整合型载体的方法

1．5．3 基于PCR的多片段组装技术

1．5．4 外源生物合成途径的基因表达调控

1．6 本课题研究的内容及意义

第二章 β-胡萝卜素生物合成途径基因的克隆与表达

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 仪器设备

2．2．2 生物材料

2．2．3 生化试剂和药品

2．2．4 试剂和培养基配方

2．3 实验方法

2．3．1 质粒抽提、酶切、连接等分子生物学操作

2．3．2 酿酒酵母电转化感受态细胞的制备及转化

2．3．3 红法夫酵母RNA的抽提与胡萝卜素基因的克隆

2．3．4 酿酒酵母类胡萝卜素的抽提及HPLC分析

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 β-胡萝卜素合成基因的克隆

2．4．2 β-胡萝卜素合成途径在2μ质粒上的构建

2．4 本章小结

第三章 酿酒酵母代谢途径组装新载体工具的构建

3．1 前言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 生物材料

3．2．2 生化试剂及培养基

3．3 实验方法

3．3．1 常规分子生物学操作

3．3．2 CPEC法构建质粒

3．3．3 pMRI载体的使用及marker循环利用测试

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 pMRI基本载体骨架的构建

3．4．2 pMRI表达载体的构建

3．4．3 pMRI质粒的使用

3．4．4 loxP-KanMX-pBR32ori-loxP的循环利用测试

3．5 本章小结

第四章 利用分散式组装策略构建可控性β-胡萝卜素生物合成途径

4．1 引言

4．2 仪器设备、试剂、药品和引物

4．3 实验方法

4．3．1 β-胡萝卜素、番茄红素标准曲线制作

4．3．2 HPLC分析条件

4．3．3 培养基中葡萄糖浓度的测定

4．3．4 表达载体的构建和代谢途径的组装

4．3．5 GAL80基因的敲除

4．3．6 菌株的基因型检测

4．3．7 菌株的摇瓶发酵

4．3．9 菌株的遗传稳定性分析

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 类胡萝卜素标准曲线的建立

4．4．2 功能模块和菌株的构建

4．4．3 半乳糖诱导类胡萝卜素的生物合成

4．4．4 葡萄糖控制型胡萝卜合成途径的构建

4．4．5 菌株的遗传稳定性分析

4．5 本章小结

第五章 利用顺序控制策略提高酿酒酵母中类胡萝卜素的产量

5．1 引言

5．2 实验仪器材料与试剂

5．3 实验方法

5．3．1 角鲨烯和FOH标准曲线制作

5．3．2 发酵液中角鲨烯和FOH的抽提

5．3．3 乙醇标准曲线制作及样品中乙醇含量分析

5．3．4 载体及菌株的构建

5．3．5 实时荧光定量PCR和半定量PCR检测基因的表达变化

5．3．6 酿酒酵母的高密度发酵

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 角鲨烯、FOH、乙醇标准曲线

5．4．2 启动子强度的比较

5．4．3 利用PBTS1下调ERG9基因的表达

5．4．4 构建β-胡萝卜素和角鲨烯合成途径的顺序控制系统

5．4．5 优化顺序控制策略进一步提高类胡萝卜素产量

5．4．6 YXWP-101(+)的高密度发酵

5．5 本章小结

第六章 结合定向进化与代谢工程提高酿酒酵母中番茄红素的产量

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 菌株质粒及其它生物材料

6．2．2 仪器、试剂、药品和引物

6．3 实验方法

6．3．1 分子生物学操作

6．3．2 生物信患学分析

6．3．3 酿酒酵母的培养和产物分析

6．3．4 番茄红素合成途径中关键酶的选择和改造原理

6．3．5 酿酒酵母代谢途径中关键酶定向进化的基本流程

6．3．6 pUMRI载体及菌株的构建

6．4 实验结果与讨论

6．4．1 不同来源八氢番茄红素基因对酿酒酵母产番茄红素的影响

6．4．2 CrtYB的定向进化

6．4．3 整合型番茄红素合成途径的组装

6．4．4 CrtE的定向进化

6．4．5 CrtI的定向进化

6．4．6 不同拷贝数Crt基因对番茄红素产量的影响

6．4．7 番茄红素的高密度发酵生产

6．5 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

作者简历