细胞和分子传感器及其在海洋生物毒素检测中的应用研究

摘要

海洋生物毒素是一类由赤潮藻产生的小分子化合物，通过贝类滤食后进入贝肉体内并且完成生物富集。一旦人们误食了被毒素污染的贝肉，就会引起中毒，严重时甚至会导致死亡。近年来，随着环境污染的加剧，由于误食被污染的贝类而引起的人类死亡事件也常有报道。目前用来检测海洋毒素的方法主要有小鼠生物法(MBA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)等。然而，这些方法在实际应用中都有一定的局限性，例如重复性差、设备昂贵以及涉及动物伦理等问题。作为一门新兴的检测技术，生物传感器是一种以细胞分子等生物材料为敏感元件，结合了物理化学等二级传感器来实现对于各种物质进行检测的分析系统。由于其具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、小型化和容易实现自动化等优点，生物传感器在细胞生理、药物筛选以及食物检测等领域都有着广泛的应用。
　　本论文基于细胞分子水平上检测海洋毒素的机理不同，结合了特定类型的二级传感器与检测系统，分别从细胞、抗体和适配体三个方面分别研究了生物传感器在海洋毒素检测中的应用潜力。
　　本论文的主要的创新点工作包括:
　　1.提出了一种基于细胞阻抗传感器的用于检测贝类腹泻性毒素的新方法
　　构建了一种基于人类细胞株的细胞阻抗传感器，并将其应用到腹泻性毒素的检测中。当毒素浓度在10-100μg/L的范围内，该传感器检测到的细胞阻抗值与毒素的浓度呈良好的线性关系。并且通过检测其他毒素与贝肉基质的干扰实验，可以证明该方法具有很好的特异性与重复性，且与小鼠生物法有着很好的相关性。说明该方法对于贝肉中腹泻性毒素的检测方面具有很好的应用潜力。
　　2.提出了一种基于神经瘤细胞的阻抗传感器的麻痹性毒素检测的改进方法
　　基于麻痹性毒素能够特异性结合细胞膜上钠离子通道的特性，建立了一种新的基于小鼠神经瘤细胞的阻抗传感器检测麻痹性毒素的方法。采用了细胞钠离子通道激活剂的藜芦定和钠钾泵抑制剂的乌本苷共同作用小鼠神经瘤细胞，细胞会因为钠离子持续性内流而引起死亡，但是麻痹性毒素可以通过阻碍钠离子内流来延缓藜芦定和乌本苷引起的细胞死亡。当麻痹性毒素的代表性毒素石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)浓度在0.1-1000nM的范围内，细胞的相对存活率与STX浓度的对数呈良好的线性关系。且该方法具有很好的特异性与灵敏度，可以用于麻痹性毒素的实际样品检测。
　　3.提出了一种基于纳米金修饰的声表面波免疫传感器，实现了大田软海绵酸(OA)的特异性检测
　　由于OA的分子量很小，因此本章采用免疫竞争分析法来检测贝肉中OA的含量。纳米金标记的二抗能够放大传感器的检测信号，且传感器检测信号与OA浓度在10-150ng/mL之间有着很好的线性关系，检测限为5.45ng/mL。并且通过与ELISA方法的对比实验，说明该方法具有很好的特异性和准确性，且能够用于贝肉实际样品中OA的特异性检测。
　　4.设计了一种基于核酸适配体的声表面波传感器用于OA的高灵敏检测
　　基于核酸适配体能够特异性结合OA分子以及DNA双链互补杂交的特性，设计一种基于核酸适配体的三明治结构用来检测样品中的OA分子。当存在OA分子时，适配体链便会与OA形成特异的结构，从而从传感器表面脱落下来，引起传感器的相位幅值增大。当OA浓度在1-100ng/mL范围内，传感器相位幅值的增大与OA浓度之间呈一定的线性关系，且检测限为0.3ng/mL。该方法为生物毒素的检测提供了一个新的思路，且三明治结构的设计也具有一定的通用性。此外，适配体作为敏感元件不仅降低了检测成本也缩短了检测时间。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 海洋生物毒素的定义及其分类

1．2．1 腹泻性贝类毒素(DSP)

1．2．2 麻痹性贝类毒素(PSP)

1．2．3 神经性贝类毒素(NSP)

1．2．4 记忆丧失性贝类毒素(ASP)

1．2．5 原多甲藻酸贝类毒素(AZP)

1．2．6 西加鱼毒素(CFP)

1．2．7 其他海洋毒素

1．3 海洋生物毒素现有检测方法及存在问题

1．3．1 生物学检测方法

1．3．2 化学分析方法

1．4 生物传感器在海洋生物毒素检测中的应用及发展趋势

1．4．1 生物传感器的应用

1．4．2 生物传感器的发展趋势

1．5 论文主要内容

第二章 ECIS阻抗传感器及其检测系统

2．1 引言

2．2 细胞阻抗传感器检测原理

2．2．1 细胞阻抗模型

2．2．2 细胞生长检测原理

2．3 细胞阻抗传感器芯片及检测系统

2．3．1 细胞阻抗传感器芯片的设计加工

2．3．2 细胞阻抗传感器的检测系统

2．3．3 细胞阻抗传感器的性能测试

2．4 细胞阻抗传感器的构建

2．4．1 细胞生长实验检测

2．4．2 与CCK8实验相比较

2．5 本章小结

第三章 基于ECIS用于检测腹泻性贝类毒素的研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 毒素与相关试剂

3．2．2 细胞与细胞培养

3．3 实验方法

3．3．1 ECIS传感器用于细胞生长状态的检测

3．3．2 ECIS传感器用于OA的检测

3．3．3 OA对细胞形态的影响

3．3．4 CCK8法用于OA标准毒素的检测

3．3．5 小鼠生物法检测OA

3．3．6 HPLC-MS／MS法检测OA

3．4 结果与分析

3．4．1 用于检测OA的ECIS传感器的构建与优化

3．4．2 ECIS传感器用于OA的检测

3．4．3 OA对细胞形态的影响

3．4．4 ECIS传感器法与CCK8法结果比较

3．4．5 ECIS传感器对于OA检测的特异性研究

3．4．6 ECIS传感器用于贝肉实际样品的分析

3．4．7 与MBA法的比较

3．5 本章小结与讨论

第四章 ECIS用于检测麻痹性贝类毒素的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 毒素及相关试剂

4．2．2 细胞培养

4．3 实验方法

4．3．1 ECIS传感器用于Neuro2a细胞生长的检测

4．3．2 ECIS传感器用于STX的分析

4．3．3 STX在OV存在下对细胞形态的影响

4．3．4 小鼠生物法检测PSP

4．3．5 ELISA法检测PSP

4．4 结果与分析

4．4．1 基于Neuro2a细胞的ECIS传感器的构建与优化

4．4．2 藜芦定和乌本苷浓度的优化

4．4．3 基于Neuro2a细胞的ECIS传感器用于STX的检测

4．4．4 STX在藜芦定和乌本苷作用下对细胞形态的影响

4．4．5 基于Neuro2a细胞的ECIS对STX特异性检测研究

4．4．6 基于Neuro2a细胞的ECIS传感器对于贝肉实际样品的分析

4．5 本章小结与讨论

第五章 基于声表面波(SAW)免疫传感器的研究

5．1 引言

5．2 SAW器件的检测原理与类型

5．3 芯片与测试系统

5．3．1 SAW芯片设计加工

5．3．2 传感器检测系统

5．4 实验材料

5．5 实验方法

5．5．1 OA-BSA偶联物的制备

5．5．2 免疫传感器的构建

5．2．3 ELISA法检测贝肉样品

5．6 实验结果

5．6．1 免疫传感器的检测原理

5．6．2 电化学方法表征传感器表面OA-BSA的固定

5．6．3 纳米金信号放大

5．6．4 实验条件的优化

5．6．5 免疫传感器的检测范围以及检测限

5．6．6 免疫传感器的特异事性测试

5．6．7 免疫传感器的准确性测试

5．6．8 实际样品分析

5．7 本章小结与讨论

第六章 基于核酸适配体传感器的贝类样品中OA检测方法的研究

6．1 引言

6．2 实验材料

6．3 实验方法

6．3．1 纳米金的制备和表征

6．3．2 纳米金颗粒标记巯基修饰的探针链

6．3．3 SAW传感器芯片的修饰

6．3．4 样品的检测

6．4 实验结果

6．4．1 适配体传感器的检测原理

6．4．2 适配体传感器构建过程的表征

6．4．3 纳米金信号放大

6．4．4 实验条件的优化

6．4．5 适配体传感器的检测范围以及检测限

6．4．6 OA检测的选择性

6．4．7 传感器的再生性以及重复性

6．4．8 实际样品的检测和分析

6．5 本章小结与讨论

第七章 总结和展望

7．1 研究总结

7．2 工作展望

参考文献

作者简历

攻读学位期间发表的论文和成果

致谢