基于组学分析乙酸诱导的酿酒酵母程序性死亡研究

摘要

在乙醇发酵中，乙酸是典型的有害抑制剂，不仅降低酒的品质损害传统酿酒发酵，而且诱导酵母死亡阻碍新兴纤维素乙醇生产。开展酵母在乙酸胁迫下的死亡和代谢研究，有助于挖掘酵母在逆境下的应激和抗性机制，并为乙酸高抗性菌株开发以及生产调控提供理论指导。本文就该问题展开对乙酸诱导的酵母程序性死亡表型，以及酵母在转录和代谢水平上的应激和代谢响应机制的研究，并探究乙酰化平衡对酵母死亡的影响，以及酵母Atg22p参与细胞死亡和抗性的关联机制研究。主要研究结果如下:
　　1.在pH3.0至6.0的培养条件下，pH的变化不会对酵母的死亡产生显著性影响，而在pH3.0培养条件下，乙酸处理浓度超过30 mM就会引起酵母细胞的死亡和线粒体降解显著增加;同时高浓度乙酸处理也会引起酵母胞内结构和胞外形态的明显改变，且细胞内的胞质pH和线粒体基质pH在高浓度乙酸处理下均会大幅降低。
　　2.RNA-seq比较转录组学分析表明，乙酸处理导致胞内参与氨基酸合成、渗透酶和胞内转运体、细胞壁完整性途径、NAD(P)/NAD(P)H和胞内pH内稳态等的基因被系统性地抑制，同时胞内碳代谢和脂代谢相关基因表达也被极大地改变，参与泛素依赖蛋白分解进程、囊泡运输和内质网上蛋白折叠的大量基因表达被加强，此外胞内组蛋白乙酰化和部分去乙酰化基因的表达也被显著改变。
　　3.GC/MS分析发现，在乙酸胁迫下，所有被检测到的胞内氨基酸均被全面下调，同时糖代谢上游代谢物发生积累，而下游代谢物则受到不同程度的下调，同时胞内长链脂肪酸大量增加。
　　4.将10个关键组蛋白乙酰化和去乙酰化基因进行过表达，6个关键基因的过表达导致细胞在乙酸逆境中的死亡增加，同时6个乙酰化和去乙酰化基因敲除同样引起细胞死亡上升;当用去乙酰化抑制剂处理细胞后，在较低抑制剂剂量下，细胞的死亡略有减少，而当增大剂量后，酵母的死亡大幅上升。
　　5.控制氨基酸代谢流的ATG22基因敲除后，细胞在乙酸胁迫下的死亡大幅减少，并伴随ROS的减少和线粒体膜电位的上升，同时ATG22的过表达，也会导致细胞的死亡增加;对Atg22p蛋白进行GFP荧光蛋白融合和可视化观察可知，在乙酸胁迫下，Atg22p高表达的GFP阳性细胞的死亡率更高，且酵母Atg22p被逐渐降解;ATG22敲除导致酵母胞质氨基酸积累，同时也会引起热休克蛋白家族、细胞壁完整性途径及部分自噬基因的转录上升。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 绪论

1．1 酵母在生物乙醇生产中的应用与逆境挑战

1．1．1 酵母在生物乙醇产业中的应用

1．1．2 第二代生物乙醇生产中的逆境挑战

1．1．3 应对木质纤维生物乙醇生产逆境的解决方案

1．2 酵母作为模式生物应用于程序性死亡研究

1．2．1 多细胞生物中的程序性死亡

1．2．2 酵母中的程序性死亡

1．2．3 程序性死亡相关疾病和衰老的酵母模型

1．3 乙酸诱导酵母的应激和死亡代谢

1．3．1 酵母在乙酸胁迫下的应激和适应性

1．3．2 乙酸诱导酵母的程序性死亡

1．4 本课题研究意义和主要研究内容

1．4．1 研究意义

1．4．2 主要研究内容

2．1 前言

2．2 实验材料与设备

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 培养基与主要试剂

2．2．3 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 菌株培养与生长曲线测定

2．3．2 检测不同pH和乙酸浓度下的存活率

2．3．3 检测不同pH和乙酸浓度下的线粒体荧光蛋白表达

2．3．6 胞质pH(pHcyt)和线粒体基质pH(pHmit)检测与分析

2．4 结果与分析

2．4．1 不同pH和乙酸浓度对酿酒酵母存活率的影响

2．4．2 不同pH和乙酸浓度对酵母线粒体功能的影响

2．4．3 不同pH和乙酸浓度对酵母程序性死亡的影响

2．4．4 乙酸处理对酵母超徼结构和形态的影响

2．4．5 乙酸处理对酵母胞内pH的影响

2．5 讨论

第三章 基于RNA-Seq转录组分析乙酸诱导的程序性死亡调控

3．1 前言

3．2 实验材料与设备

3．2．1 菌株与引物

3．2．2 培养基与主要试剂

3．2．3 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 乙酸处理与酵母总RNA提取

3．3．2 RNA-seq转录组测序

3．3．3 基因表达谱的生物信息学分析

3．3．4 转录组数据的实时焚光定量PCR验证

3．4 结果与分析

3．4．1 RNA-seq转录谱质控报告

3．4．2 不同处理时间的转录组差异表达基因(DEGs)总体分析

3．4．3 两个时间点以上共同差异表达基因(DEGs)分析

3．4．4 三个时间点共同DEGs蛋白互作网络分析

3．4．5 酵母在乙酸胁迫下随时间序列的转录变化

3．4．6 实时荧光定量PCR验证

3．5 讨论

4．1 前言

4．2 实验材料与设备

4．2．1 菌株与培养基

4．2．2 实验试剂

4．2．3 仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．1 胞内代谢物的提取和衍生化

4．3．2 GC／MS检测

4．3．3 数据分析

4．4 结果与分析

4．4．1 酵母代谢图谱与多元统计分析

4．4．2 乙酸处理组与对照组间的代谢差异

4．4．3 乙酸处理组在时间序列上的代谢变化

4．5 讨论

5．1 前言

5．2 实验材料与设备

5．2．1 菌株与质粒

5．2．2 培养基与主要试剂

5．2．3 仪器与设备

5．3 实验方法

5．3．1 重组质粒和过表达酵母菌株构建

5．3．2 Annexin V／PI双染分析

5．3．3 碘化丙啶(PI)染色分析

5．4 结果与分析

5．4．1 组蛋白乙酰化和去乙酰化基因过表达对酵母在乙酸胁迫下的死亡影响

5．4．2 组蛋白乙酰化和去乙酰化基因敲除对酵母在乙酸胁迫下的死亡影响

5．4．3 乙酰化抑制剂改变乙酰化平衡对酵母在乙酸胁迫下的死亡影响

5．5 讨论

第六章 ATG22敲除与过表达对乙酸诱导程序性死亡的影响

6．1 前言

6．2 实验材料与设备

6．2．1 菌株与质粒

6．2．2 培养基与实验试剂

6．2．3 仪器与设备

6．3 实验方法

6．3．1 ATG22过表达和GFP标记菌株构建

6．3．2 生长曲线测定和程序性死亡分析

6．3．3 Atg22追踪和PI染色分析

6．3．4 酵母胞内和液泡氨基酸的检测

6．4．1 ATG22敲除减少乙酸引起的细胞死亡

6．4．2 Atg22p过表达增强乙酸引起的细胞死亡

6．4．3 ATG22敲除使细胞在乙酸胁迫下的胞内氨基酸积累

6．4．4 ATG22敲除促进乙酸胁迫下的热休克蛋白家族、细胞壁完整性途径及部分自噬基因的转录

6．5 讨论

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录

作者简介及在读期间所取得科研成果

致谢