酿酒酵母JJJ1基因敲除提高乙酸耐性和纤维乙醇发酵性能

摘要

木质纤维素原料预处理过程中会产生各种对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)生长与发酵有影响的抑制物，如弱酸、呋喃衍生物和酚类化合物等。乙酸是半纤维素降解产生的一种主要抑制物，未解离的乙酸可以通过质膜简单扩散进入酵母细胞，引起胞内酸化，从而抑制细胞代谢与生长，降低纤维乙醇生产效率。因此，酿酒酵母耐乙酸分子机制的揭示和阐明，对合理设计发酵条件，指导构建适应较高浓度乙酸环境、提高纤维乙醇发酵效率的酿酒酵母工程菌株均具重要的意义。
　　在课题组前期研究中，发现当酵母细胞在含有多种抑制物的木质纤维素水解液中生长时，JJJ1基因的表达量出现下调。为了弄清在纤维素水解液中酵母细胞面对抑制物时JJJ1的作用，本文首先对酿酒酵母菌株BY4741及其基因敲除菌株BY△JJJ1的多种胁迫耐性进行比较，发现BY△JJJ1对甲酸和乙酸的胁迫耐性显著增强。在5.5g/L乙酸、1.2g/L甲酸或各种抑制物混合的纤维素水解液(3.0g/L乙酸、0.2g/L甲酸、1.1g/L糠醛和0.2g/L5羟甲基糠醛)中，发酵开始和结束时间较亲株均提前了17h以上。JJJ1敲除对工业菌株YJSH1乙酸耐性提高也具有相同的效果。通过对乙酸相关的生理生化因子的分析，发现乙酸胁迫下，BY JJJ1细胞内的乙酸积累较BY4741减少了7.8％以上，海藻糖增加了37.6％以上;同时，细胞膜中长链脂肪酸的比例增加了12.3％，麦角固醇含量减少了12％，细胞内超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT活性也有所增加。利用RNA测序技术对野生型菌株BY4741和敲除菌BY△JJJ1的转录组进行分析，结果显示在BY△JJJ1菌株中约有218个基因表达量发生了较大变化。对这些基因在DAVID数据库中进行聚类分析，发现碳水化合物代谢和细胞膜上一些转运蛋白相关基因表达量下调;同时，细胞壁功能和核糖体相关基因表达量上调。结合两个菌株若干生理生化指标差异分析，提示JJJ1敲除后，细胞壁有关蛋白的表达量升高，细胞壁重构更加强化，减少了进入细胞内的乙酸量，从而减少了乙酸对细胞的毒害作用;而葡萄糖分解有关基因表达量下降，最终表现出在正常条件下生长速率较慢，但在乙酸胁迫下生长速率更快于野生型的现象。
　　研究结果深化了对酿酒酵母耐乙酸机理的理论认识，为优化纤维乙醇工艺、构建高抗逆酿酒酵母工业应用菌株、提高纤维乙醇发酵效率提供了理论指导与技术支撑。

目录

声明

致谢

摘要

文献综述 酿酒酵母乙酸耐性机制的研究

1 酿酒酵母乙酸毒性的分子机制

2 酿酒酵母乙酸耐性机制

2．1 细胞膜有关基因与乙酸耐性

2．2 细胞壁有关基因与乙酸耐性

2．3 氨基酸和能量代谢有关基因与乙酸耐性

2．4 金属离子代谢有关基因与乙酸耐性

2．5 核糖体有关基因与乙酸耐性

2．6 转录因子有关基因与乙酸耐性

3 总结和展望

前言

材料与方法

1 菌株与质粒

1．1 菌株

1．2 质粒

2 培养基的配制

2．1 YPD培养基

2．2 YPAD培养基

2．3 YNB培养基

2．4 LB培养基

2．5 YPG培养基

2．6 发酵培养基

3 主要试剂及溶液

4 主要仪器

5 实验方法

5．1 基因操作

5．2 发酵性能测试

5．3 菌株耐受性测试

5．4 胞内乙酸含量的测定

5．5 生理生化测定

5．6 细胞抗氧化检测

5．7 RNA测序(RNA-Seq)

结果与讨论

1 JJJ1在酵母菌株中的表型效应

1．1 多种抑制物耐性比较

1．2 发酵性能比较

2 JJJ1突变株生理生化分析

2．1 酿酒酵母胞内乙酸和细胞膜组成

2．2 酿酒酵母胞内海藻糖含量

2．3 BY4741和BYΔJJJ1酶活比较

3 JJJ1的表达调控和功能研究

3．1 菌株BYΔJJJ1下调基因

3．2 菌株BYΔJJJ1上调基因

全文总结

创新点

展望

参考文献

在读期间发表论文及申报专利