苦苣菜黄网病毒基因组末端顺式作用元件突变分析

摘要

不分节段负链RNA病毒基因组3'和5'末端非编码区分别为leader和trailer序列，leader和trailer部分碱基可互补配对形成锅柄状二级结构，该区域包含病毒基因组复制和mRNA转录起始所必需的顺式作用元件。随着动物负义RNA病毒的反向遗传学体系的建立，研究人员对动物负义RNA病毒的末端顺式作用元件进行了一系列的研究，发现了病毒转录与复制的关键调控序列，也揭示了相关的二级结构在病毒转录与复制中的作用。然而由于缺乏可用的反向遗传学体系，人们对侵染植物的负义RNA病毒的末端顺式作用元件的功能所知甚少。苦苣菜黄网病毒(Sonchusyellow net virus，SYNV)属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），细胞核弹状病毒属（Nucleorhabdovirus），是侵染植物的不分段的负义RNA病毒，其leader与trailer序列也能部分互补配对，形成茎环状二级结构。本研究利用实验室前期构建的表达eGFP和DsRed报告基因的SYNV微型复制子(Minireplicon，MR)系统，对SYNV基因组末端leader和trailer的部分序列进行了一系列的缺失、置换、颠换等突变分析，初步探索了其在病毒mRNA转录中的作用。
　　首先，通过快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)分析，明确了SYNV微型复制子末端leader和trailer的序列与NCBI数据库中SYNV病毒的末端序列一致。结构预测发现leader和trailer前30nt形成的二级结构中，1-17 nt配对程度高，形成茎(stem)结构，leader上第18-21 nt、第28 nt分别形成四碱基凸起（bulgel）和单碱基凸起(bulge2)。
　　1.茎(stem)的突变分析
　　对1-17 nt预测形成的stem进行缺失突变分析发现，leader缺失末端3nt、6nt或10nt，SYNV-MR报告基因转录水平都显著降低，且其下降的程度与缺失的碱基数目直接相关;相似地，trailer缺失3nt、5nt、10nt后报告基因转录水平显著降低，且下降程度一致。进一步在trailer区打开stem结构配对，随着打开碱基对的增加，SYNV-MR报告基因转录水平依次下降;但将stem结构中leader和trailer区序列进行不同程度的互换，SYNV-MR报告基因几乎不表达。这些结果能够说明leader3，末端序列包含病毒转录的启动子序列，trailer可能通过与leader互补配对参与病毒的转录过程。
　　2.bulge1的突变分析
　　针对四碱基凸起bulge1的UUUA做了一系列的突变分析，发现缺失UUUA，SYNV-MR报告基因不表达;在trailer上增加AAAU使之互补后，SYNV-MR报告基因表达水平下降近一半，这说明bulge1凸起结构和凸起上的碱基序列对病毒转录起重要作用。接着变换4个碱基序列发现，碱基都为A/U时，不影响病毒转录。而碱基都为C/G时，病毒转录水平严重下降。有趣的是，保持中间2个碱基为GG或CC，两边2个碱基为A/U，病毒转录也几乎不受影响。而保持3个碱基顺序不变，一次只将首尾一个碱基变为G/C，发现只有突变体UUUG转录水平较野生型UUUA有所下降。同时发现，4个碱基中G/C比例高或G/C位于两边，都会下调报告基因mRNA的转录水平。
　　3.bulge2的突变分析
　　对leader上第28位碱基U(bulge2)进行突变分析发现，该碱基在病毒转录过程中起重要作用。将其缺失后，SYNV-MR报告基因只有微弱的表达;将其调换到相应的trailer区，报告基因几乎不表达。而在trailer区增加碱基A使其互补配对后，SYNV-MR转录水平也会下调。将U进行置换发现，U变为A或G是对病毒转录无影响，而变为C时病毒转录水平下调近50％。这表明，bulge2的U对病毒转录很重要，碱基C下调病毒转录水平，同时这个凸出的环可能有利于病毒RNA聚合酶的识别。
　　综上所述，SYNV leader和trailer前10nt在病毒mRNA转录过程中发挥重要作用，trailer可能通过与leader互补配对参与病毒mRNA转录过程;二者所形成的环状凸起bulge，可能有利于病毒RNA聚合酶的识别。

目录

声明

致谢

摘要

1 综述

1．1 苦苣菜黄网病毒概述

1．1．1 苦苣莱黄网病毒分类、寄主及传播介体

1．1．2 苦苣菜黄网病毒粒子形态与理化性质

1．1．3 苦苣菜黄网病毒的基因组结构及功能

1．1．4 SYNV转录与复制

1．2 病毒反向遗传学

1．2．1 正链RNA病毒反向遗传学

1．2．2 负义RNA病毒反向遗传学

1．3 不分段的负义RNA病毒基因组末端顺式作用元件研究

1．3．1 弹状病毒科

1．3．2 副粘病毒科

1．3．3 其它病毒科

1．4 本论文的研究目的及意义

2 实验方法

2．1．常规分子克隆技术

2．1．1 PCR

2．1．2 凝胶回收

2．1．3 限制性内切酶酶切与连接酶连接

2．1．4 Infusion

2．1．5 转化

2．1．6 菌落PCR筛选

2．1．7 少量质粒的提取

2．1．8 重组质粒酶切及测序鉴定

2．2 农杆菌浸润接种

2．2．1 农杆菌感受态制备与电击转化

2．2．2 农杆菌浸润接种本氏烟

2．3 核酸相关技术

2．3．1 CTAB法提取植物DNA

2．3．2 植物总RNA提取方法

2．3．3 RT-PCR制备cDNA

2．4 Western blot

2．4．1 植物总蛋白的提取

2．4．2 SDS-PAGE电泳

2．4．3 半干法转膜

2．4．4 Western blot

3 SYNV微型复制子末端序列突变分析

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 SYNV原始毒源和侵染性克隆接种本氏烟

3．1．3 引物设计

3．1．4 RNA提取与RT-PCR

3．1．5 高保真PCR扩增目的片段

3．1．6 目的片段连pLB载体测序

3．1．7 SYNV-MR突变体构建

3．1．8 突变载体转化农杆菌并浸润本氏烟

3．1．9 荧光观察及样品采集

3．1．10 SDS-PAGE电泳及Western Blot检测

3．2 结果与分析

3．2．1 SYNV微型复制子末端序列确定

3．2．2 SYNV微型复制子末端序列突变分析

3．2．3 讨论

4 全文总结

参考文献

附录