生防酵母细胞壁物质在诱导果实抗性中的作用分析

摘要

真菌性病害是导致果实采后损失的主要因素之一。生防酵母作为重要的采后生物防治拮抗菌，其拮抗机理主要包括营养和空间竞争、分泌胞外活性物质、重寄生作用和诱导寄主产生抗性这四个方面，但目前尚未报道其诱导果实抗性所依赖的物质基础。本论文以罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)和海洋红冬孢酵母(Rhodosporidium paludigenum)这两种生防酵母为目标酵母，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为对照酵母，研究了灭活酵母菌体和酵母细胞壁对果实抗性的诱导作用及其主要影响因素，并通过分析酵母菌体和细胞壁对病原菌、对果实抗性相关生理生化指标和基因表达情况的影响等，探讨了酵母菌体和细胞壁诱导果实抗性的相关机理，同时通过比较酵母细胞壁物质对诱导抗性效果的影响，初步揭示了生防酵母诱导果实抗性所依赖的物质基础。主要研究结论如下:
　　(1)S.cerevisiae、C.laurentii和R.paludigenum在活体条件下能直接抑制梨果实的青霉病(Penicillum expansum)。灭活之后的酵母菌体不能直接抑病，但湿热灭活的菌体能诱导梨果实产生对青霉病的抗性，其中R.paludigenum灭活菌体的效果最好，其诱导抗性的效果与灭活菌体的浓度、诱导时间和病原菌孢子浓度有关。此外，一定浓度(1×106-1×107 cells/mL)的R.paludigenum灭活菌体能诱导樱桃番茄果实产生对黑斑病(Alternaria alternata)的抗性。抑菌试验表明，1×105-1×108 cells/mL的R.paludigenum灭活菌体在梨果实体外不能抑制P.expansum的生长和孢子萌发;而在果实体内，当1×107 cells/mL的R.paludigenum菌体处理24 h后再接入病原菌P.expansum，能显著抑制伤口处P.expansum孢子的萌发。
　　(2)梨果实抗性相关生理指标的测定结果表明，R.paludigenum灭活菌体处理能显著刺激梨果实超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的升高，降低丙二醛(MDA)含量，说明灭活酵母菌体诱导果实抗性的生理机制与清除果实组织细胞内过量活性氧(ROS)积累，缓解细胞内氧化损伤以及苯丙烷代谢通路有关。另一方面，R.paludigenum灭活菌体处理对梨果实β-1，3-葡聚糖酶(GLU)和几丁质酶(CHI)活性的激发作用不明显。
　　(3)酵母细胞壁能显著诱导梨果实产生对青霉病的抗性，不同酵母细胞壁之间的诱导效果差异不大，C.laurentii细胞壁和R.paludigenum细胞壁的效果最好。细胞壁蛋白对诱导梨果实抗性没有显著影响，细胞壁多糖起主要作用。果实抗性相关酶活性的测定结果表明，R.paludigenum细胞壁诱导处理后再接入病原菌P.expansum，梨果实的GLU和CHI活性均快速升高，显著高于对照组、细胞壁单独处理组和P.expansum单独处理组，说明酵母细胞壁诱导梨果实的抗性存在Priming机制。果实PR基因的表达情况表明，R.paludigenum细胞壁处理能刺激梨果实PR1基因上调表达，在接入病原菌后上调表达更为显著，说明细胞壁处理能诱导梨果实产生系统获得性抗性(SAR)，并且在受到病原菌攻击时表现出更强的抗性反应;梨果实的GLU基因和CHI4基因也参与抗性反应，并且在基因水平上也表现出Priming效应，而CHI3基因可能不参与抗性反应。
　　(4)S.cerevisiae、C.laurentii和R.paludigenum的细胞表面特性和细胞壁结构差异明显，生防酵母细胞表面的褶皱和纤维状延伸可能与其拮抗活性有关。湿热灭活对酵母细胞内部有破坏作用但对细胞整体结构没有显著影响，细胞壁基本保持完整。不同种属酵母之间的细胞壁组成有差异，细胞壁几丁质可能在果实抗性的诱导过程中起重要作用。细胞壁诱导果实抗性不单单是物质的效应，可能还与多糖的结构以及连接状态有关。

目录

声明

致谢

摘要

1．1 果实采后病害防治方法

1．1．1 物理方法

1．1．2 化学方法

1．1．3 生物方法

1．2 诱导抗性概述

1．2．1 诱导抗性的激发子

1．2．2 诱导抗性的类型

1．2．3 诱导抗性的过程

1．3 酵母细胞壁研究进展

1．3．1 酵母细胞壁的结构

1．3．2 细胞壁完整性通路

1．3．3 酵母细胞壁物质在食品领域中的应用

1．3．4 酵母细胞壁物质在果实采后病害防治中的研究现状

1．4 本课题的研究意义与主要内容

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．2 灭活酵母菌体制备

2．2．3 主要仪器与设备

2．2．4 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 活体酵母与灭活酵母菌体对梨果实青霉病的直接抑制作用

2．3．2 灭活酵母菌体对梨果实青霉病抗性的诱导作用

2．3．3 培养时问对灭活酵母菌体诱导梨果实青零病抗性的影响

2．3．4 诱导时间对灭活酵母菌体诱导梨果实青霉病抗性的影响

2．3．6 灭活酵母菌体对樱桃番茄果实黑斑病抗性的诱导作用

2．3．7 灭活酵母菌体对扩展青零体外生长的影响

2．3．8 灭活酵母菌体对扩展青零在梨果实伤口处生长的影响

2．4 讨论

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 果实、病原菌与灭活酵母菌体

3．2．2 主要仪器与设备

3．2．3 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．3 灭活酵母菌体对梨果实POD活性的影响

3．3．4 灭活酵母菌体对梨果实MDA含量的影响

3．3．5 灭活酵母苗体对梨果实PAL活性的影响

3．3．6 灭活酵母菌体对梨果实GLU和CHI活性的影响

3．4 讨论

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．2 酵母细胞壁制备

4．2．3 主要仪器与设备

4．2．4 实验方法

4．3 结果与分析

4．3．1 酵母细胞破壁效果观察

4．3．2 酵母细胞壁对梨果实青霉病抗性的诱导作用

4．3．3 不同酵母细胞壁诱导果实抗性的作用比较

4．3．4 酵母细胞壁蛋白对诱导果实抗性的影响

4．3．5 酵母细胞壁对扩展青霉体内和体外孢子萌发的影响

4．3．6 酵母细胞壁对梨果实β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶活性的影响

4．3．7 酵母细胞壁对梨果实PR基因表达情况的影响

4．4 讨论

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 果实、病原菌、灭活酵母菌体与酵母细胞壁

5．2．2 主要仪器与设备

5．2．3 实验方法

5．3 结果与分析

5．3．1 活体酵母和灭活酵母菌体的显微形态比较

5．3．2 细胞壁多糖组成

5．3．3 酵母细胞壁和其多糖组分诱导果实抗性的作用比较

5．4 讨论

6．1 主要研究结论

6．2 主要创新点

6．3 后续研究展望

参考文献

作者简介