L-谷氨酸对果实抗性的诱导作用及其相关机理研究

摘要

在果实采后贮运实践中，由真菌病害引起的果实腐烂会造成经济上的巨大损失。尽管化学杀菌剂仍然是控制采后病害的主要防治方法，但在健康环保的理念指导下，其使用种类和范围愈发严格和局限。通过化学、物理或者生物手段激发果实内在的抗性机制防御病害已成为果实采后病害防治的新概念和新手段。作为生物体内最重要的氨基酸之一，L-谷氨酸及其钠盐被广泛应用于实际生活中的各个领域，具有安全环保，价格低廉，容易获得且使用简单等特点。L-谷氨酸在植物代谢中占据极为重要的地位，不仅参与合成多种与增强植物抗逆性相关的代谢物质，且在非生物胁迫下的逆境响应中发挥重要作用。然而目前有关它在植物病害防御反应中的作用鲜有报道。本论文以L-谷氨酸作为外源诱导因子，探讨其对果实采后病害的防治效果，并通过基因、蛋白、物质等多个水平和角度系统分析研究了L-谷氨酸对果实的抗性反应机制。研究结果不仅为开发基于L-谷氨酸的新型保鲜剂提供理论依据，而且可为研究植物抗性提供新的视角和策略。主要研究结果如下:
　　(1) L-谷氨酸可以通过诱导果实（梨、番茄、柑橘）自身的抗性来抵御或延缓其采后病害的发展，且抑制效力与诱导时间（24 h以上）、处理浓度(100 mgL-1以上)等因素密切相关。L-谷氨酸不论是以采前喷洒还是采后处理的方式均可有效提高果实对采后病原菌的抵御能力，在果实的防腐保鲜领域有广阔的应用前景。
　　(2) L-谷氨酸作为γ-氨基丁酸(GABA)前体物质，激活了番茄果实体内GABA支路上与GABA合成和代谢相关关键基因的表达;而用外源GABA处理可有效抵御番茄果实腐生型病原菌Alternaria alternate的侵染，其机理与激活果实体内GABA支路有关。GABA支路的激活一方面可能与三羧酸(TCA)循环路径的加强为防御反应提供更多的能量有关;另一方面可能是阻止了活性氧的积累减少了细胞死亡从而不利于腐生型病原菌的侵染。因此，L-谷氨酸对番茄果实抗性的诱导机制可能与GABA支路密切相关。
　　(3)呼吸跃变型果实番茄经L-谷氨酸处理后，其体内的主要氮代谢路径谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循环上的GS被激活，同时，与碳代谢有关的糖酵解路径上编码己糖激酶和丙酮酸激酶的基因和TCA循环中的苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶均被强烈诱导表达。也就是说，L-谷氨酸对A.alternata的抗性机制可能与碳氮代谢路径的激活有关。
　　(4)番茄果实经L-谷氨酸处理后，与水杨酸合成和信号路径相关的基因，如PAL、NPR1、TGA1、TGA2、WRKY70和PR基因，其转录水平明显上调;乙烯合成路径上的两个关键乙烯合成酶基因ACS、ACO和乙烯受体ETR3、ETR4的转录表达被强烈抑制;茉莉酸合成路径上的LOX1、AOS2、AOC呈下调表达趋势，其信号转导路径上的茉莉酸受体COI1，正调控转录因子MYC2和茉莉酸诱导的蛋白酶抑制剂PⅠ-Ⅱ的转录水平下降的同时，负调控转录因子JAZ1则有一定的上调趋势。由上可知，L-谷氨酸对番茄果实采后黑斑病的抗性机制可能依赖于水杨酸的合成和信号传导路径;同时谷氨酸对乙烯/茉莉酸合成与信号路径存在一定的抑制作用。
　　(5)同重同位素相对与绝对定量(iTRAQ)试验结果显示，经L谷氨酸处理后的番茄果实相对于对照组有97个蛋白显著上调表达，42个蛋白显著下调表达，且这些差异蛋白显著富集于植物与病原菌互作、苯丙烷类合成、能量代谢（氧化磷酸化和多糖类分解路径）、脂肪酸代谢等与植物抗性反应密切相关的代谢路径上。
　　(6)通过气相色谱质谱联用(GC-MS)技术分析了L-谷氨酸对番茄果实物质含量的变化，结果显示，L-谷氨酸可能激活了果实的能量代谢、氨基酸代谢和水杨酸信号路径，同时对乙烯/茉莉酸合成路径有一定的抑制效果。
　　(7)对于呼吸非跃变型果实柑橘转录表达谱的试验结果表明，在未接种病原菌Penicillium digitatum条件下，经L-谷氨酸处理后的柑橘果实相对于对照组有623个基因上调表达，647个下调表达;在接种病原菌的条件下，L-谷氨酸处理组则有234个上调基因，193个下调基因。这些差异基因涉及碳代谢，氨基酸代谢，植物激素代谢和次级代谢等多条与果实抗性密切相关的路径。
　　综上所述，L-谷氨酸可以通过诱导果实抗性有效抵御果实的病害，其机理可能与激活GABA支路、碳氮代谢和水杨酸路径，同时抑制乙烯/茉莉酸路径有关。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

简写对照表

第一章 文献综述

1 果实采后病害防治现状

1．1 果实采后侵染性病害

1．2 果实采后病害的防治措施

2 植物诱导抗性研究进展

2．1 植物诱导抗性概述

2．2 诱导抗性因子

2．3 植物激素与诱导抗性

3 谷氨酸的研究进展

3．1 谷氨酸概述

3．2 谷氨酸在植物体内的代谢路径

3．3 谷氨酸在植物响应外界胁迫环境中的研究现状

4 本课题的选题背景和研究构想

第二章 L-谷氨酸对果实抗病性的影响及规律

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2 果实、病原菌及试剂

2．3 L-谷氨酸对不同果实采后病害的影响

2．4 L-谷氨酸对病原菌生长的影响

2．5 统计分析

3 结果与分析

3．1 L-谷氨酸对不同果实采后病害的影响

3．2 L-谷氨酸对病原菌生长的影响

4 讨论

第三章 L-谷氨酸对番茄果实GABA支路的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2 果实、病原菌及试剂

2．3 GABA对樱桃番茄黑斑病的影响

2．6 实时荧光定量PCR检测

2．7 统计分析

3 结果与分析

3．1 谷氨酸对樱桃番茄GABA支路的影响

3．2 GABA对樱桃番茄黑斑病的影响

3．3 GABA对病原菌A．alternata体外生长的影响

3．4 GABA对果实抗氧化酶的影响

3．5 GABA对GABA支路和三羧酸(TCA)循环相关酶的影响

3．6 谷氨酸对脯氨酸合成代谢的影响

4 讨论

第四章 L-氨酸对番茄果实碳氮代谢的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2果实及其采后预处理

2．3 酶活性测定

2．4 实时荧光定量PCR检测

2．5 统计分析

3 结果与分析

3．1 外源谷氨酸对果实组织谷氨酸含量的影响

3．2 谷氨酸对谷氨酰胺合成酶的影响

3．3 谷氨酸对苯丙烷类代谢路径的影响

3．4 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的影响

3．5 谷氨酸对糖酵解途径相关酶的影响

3．6 谷氨酸对三羧酸循环相关酶的影响

4 讨论

第五章 L-谷氨酸对番茄果实抗性信号通路的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2 果实及其采后预处理

2．3 病原菌及孢子悬浮液制备

2．4 多效唑对谷氨酸诱导抗性的影响

2．5 酶活性测定

2．6 实时荧光定量PCR检测

2．7 统计分析

3 结果与分析

3．1 谷氨酸对水杨酸合成路径的影响

3．2 谷氨酸对水杨酸信号转导路径的影响

3．3 谷氨酸对乙烯合成路径的影响

3．4 谷氨酸对乙烯信号转导路径的影响

3．5 谷氨酸对茉莉酸合成路径的影响

3．6 谷氨酸对茉莉酸信号转导路径的影响

4 讨论

第六章 L-谷氨酸对番茄果实蛋白表达和物质代谢的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2 果实及其采后预处理

2．4 iTRAQ定量分析

2．5 统计分析

3 结果与分析

3．1 蛋白鉴定结果及差异蛋白统计

3．2 差异蛋白的GO富集分析

3．3 差异蛋白的Pathway富集分析

3．4 谷氨酸对番茄果实差异蛋白的影响及分析

3．5 谷氨酸对番茄果实体内代谢组分变化的影响

4 讨论

第七章 L-谷氨酸对柑橘果实转录组的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要仪器设备

2．2 果实、病原茵及样品制备

2．3 柑橘果实组织总RNA提取

2．4 文库的建立、测序及数据过滤

2．5 基因表达注释与差异表达基因筛选

2．6 差异表达基因Gene ontology功能分类和Pathway富集分析

3 结果与分析

3．1 测序质量评估与数据统计

3．2 差异表达基因筛选

3．3 差异表达基因的Go功能分析

3．4 谷氨酸对柑橘果实代谢通路的影响分析

4 讨论

第八章 本论文主要研究结论、创新点及后续研究展望

1 主要研究结论

2 主要创新点

3 后续研究展望

参考文献

攻读博士期间主要科研成果