大肠杆菌中新型胶原蛋白融合表达多种生长因子的研究

摘要

类胶原蛋白Scl2是一类含有高度重复氨基酸序列的蛋白质，其构象为稳定的三股螺旋结构，能够抵抗多种蛋白酶的降解，可利用酸法沉淀和酶法水解快速获得较纯的Scl2，因此将Scl2作为融合标签，在融合蛋白的纯化方面有一定的优势。Scl2-M是在Scl2的序列上整合了一些功能位点，该蛋白在大肠杆菌中可溶表达量较高。
　　人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblase growth factor，hbFGF)对于临床医学有很高的价值，能够诱导细胞增殖分化，加速骨组织发育，保护神经系统等。随着对hbFGF研究和应用的拓展，越来越多的医疗、美容等机构开始将hbFGF用于神经系统、烧伤、疾病的治疗以及化妆品中，展现了广阔的市场前景。
　　目前，hbFGF制剂昂贵，无法满足大规模的应用需求。hbFGF的制备主要通过大肠杆菌表达系统进行重组表达，但由于hbFGF基因中的某些密码子是稀有密码子，导致非融合的hbFGF在大肠杆菌中表达量不高，且极易被蛋白酶降解。此外，hbFGF的氨基酸序列上存在四个Cys残基，在溶液中极易形成分子间的二硫键，导致二聚体甚至是多聚体的形成，造成hbFGF生物活性的丧失。
　　本文首先依据大肠杆菌密码子偏好性合成了hbFGF的基因模版pUC19-hbFGF，通过PCR扩增获得hbFGF基因。利用类胶原蛋白Scl2在分离纯化方面的优势，以及Scl2-M的高可溶表达量，构建重组表达载体pET28a-Scl2-M-hbFGF，以E.coli BL21(DE3)作为表达载体，在摇瓶中对重组蛋白诱导表达的条件进行了优化。优化后的表达条件为:在TB培养基中，对数生长中期加入0.1 mM IPTG，在30C下诱导表达10h。在该条件下，融合蛋白Scl2-M-hbFGF的可溶表达量为0.85g/L。
　　利用甲醇诱导毕赤酵母GS115-EK胞外表达具有生物活性的肠激酶轻链，为后续分离纯化提供酶切工具。
　　利用Scl2的特性，通过pH沉淀法纯化融合蛋白Scl2-M-hbFGF，其蛋白回收率(＞90％)较Ni2+亲和层析纯化（约50％）有较大提高。再经过肠激酶酶切、阳离子交换层析纯化，得到高纯度的hbFGF，纯度可达90％以上。经成纤维细胞NIH/3T3测定，所得hbFGF具有生物活性，其促进细胞增殖的活性与阴性对照相比，细胞数量提升约50％。
　　以甘油作为碳源，分别通过分批发酵和补料分批发酵的方式，在5L发酵罐上对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Scl2-M-hbFGF进行高密度培养。补料分批发酵产量略高于分批发酵，融合蛋白产量达到7.7g/L，其中hbFGF理论产量为2.5g/L。补料分批发酵发酵周期更短，更适合工业化大规模应用。
　　最后，将表皮生长因子(hEGF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)和Scl2-M进行融合表达，建立了一种以Scl2-M为融合标签的高效可溶表达小分子蛋白的方法。

目录

声明

致谢

摘要

1．1 类胶原蛋白Scl2

1．1．1 Scl2的重组表达

1．1．2 Scl2的生物学功能

1．1．3 Scl2在重组表达及纯化上的应用

1．2 碱性成纤维细胞生长因子

1．2．1 bFGF的结构和功能

1．2．2 bFGF的理化性质

1．2．3 bFGF的分布

1．2．4 碱性成纤维细胞生长因子的主要生物学功能

1．2．5 碱性成纤维细胞生长因子的基因工程研究进展

1．3 胰岛素样生长因子-1

1．3．1 IGF-1的结构特性

1．3．3 IGF-1的基因工程研究进展

1．4 人表皮生长因子

1．4．1 hEGF的结构和理化性质

1．4．2 hEGF的生物学功能与应用

1．4．3 hEGF的基因工程研究进展

1．5 肠激酶

1．5．1 肠激酶的结构特点

1．5．2 肠激酶的理化和酶学特点

1．5．3 肠激酶的生理功能

1．6 大肠杆菌重组表达系统与高密度发酵

1．6．1 蛋白质可溶表达策略

1．6．2 大肠杆菌高密度发酵

1．7 蛋白质的层析分离技术及应用

1．7．1 亲和层析

1．7．2 离子交换层析

1．7．3 凝胶过滤层析

1．8 本课题的研究思路与主要研究内容

第二章 重组大肠杆菌融合表达FGF的优化研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 质粒与菌株

2．2．2 工具酶与主要试剂

2．2．3 主要仪器

2．2．4 培养基及试剂配制

2．3 实验方法

2．3．1 E．coli感受态的制备

2．3．3 引物的设计和合成

2．3．4 融合蛋白表达载体的构建

2．3．5 表达菌株的构建与验证

2．3．7 Scl2-M-hbFGF表达条件的优化

2．4 结果与讨论

2．4．1 重组质粒与重组菌的构建

2．4．2 重组菌的诱导表达

2．4．2 重组菌的诱导表达条件的优化

2．5 本章小结

第三章 融合蛋白酶切工具酶(肠激酶)在毕赤酵母中的表达研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 质粒与菌株

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器

3．2．4 培养基配制

3．2．5 试剂配制

3．3 实验方法

3．3．3 SDS-PAGE电泳验证

3．3．4 肠激酶的活性验证

3．4 结果与讨论

3．4．1 肠激酶的表达及分离纯化

3．4．2 肠激酶的活性验证

3．5 本章小结

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 质粒与菌株

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要仪器

4．2．4 培养基及试剂配制

4．3 实验方法

4．3．1 发酵液的预处理

4．3．4 Scl2-M-hbFGF融合蛋白pH沉淀纯化

4．3．6 离子交换层析分离成熟hbFGF

4．3．7 hbFGF生物活性的检测

4．4 结果与讨论

4．4．2 pH沉淀法纯化融合蛋白Scl2-M-hbFGF

4．4．3 肠激酶酶切融合蛋白Scl2-M-hbFGF

4．4．4 离子交换层析分离hbFGF

4．4．5 hbFGF的生物活性分析

4．5 本章小结

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 质粒与菌株

5．2．2 主要仪器

5．2．3 培养基的配制

5．3 实验方法

5．3．1 一级种子的制备

5．3．2 二级种子的制备

5．3．3 分批发酵与控制

5．3．4 分批补料发酵与控制

5．3．5 甘油浓度的测定

5．3．6 hbFGF的规模制备

5．4 结果与讨论

5．4．1 分批发酵

5．4．2 分批补料发酵

5．4．3 hbFGF的规模制备

5．5 本章小结

第六章 重组大肠杆菌中新型胶原蛋白融合表达其他生长因子的研究

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 质粒与菌株

6．2．2 工具酶与主要试剂

6．2．3 主要仪器

6．2．4 培养基及试剂配制

6．3．1 基因的设计和合成

6．3．2 引物的设计和合成

6．3．3 融合蛋白表达载体的构建

6．3．4 表达菌株的构建与验证

6．4．1 重组质粒与重组菌的构建

6．4．2 重组蛋白的诱导表达

6．4．3 重组蛋白Scl2-M-IGF-1诱导表达条件的优化

6．5 本章小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

作者简介