影响固体脂质纳米粒跨膜转运的制剂因素研究

摘要

固体脂质纳米粒作为一种近年来受到广泛关注的纳米给药系统，具备跨膜转运效率高、毒性低、稳定性好等优点，被认为是最有希望开发进入临床应用的口服纳米给药系统。对固体脂质纳米粒的表面进行不同的结构修饰，可达到增加载体吸收、提高药物生物利用度等目的。因此，充分研究固体脂质纳米粒的理化性质与其在胃肠道中的转运吸收机制之间的关系有助于我们合理地设计具有高效率转运特性的载体。本课题研究了影响固体脂质纳米粒跨膜转运的制剂因素，并分析了具有不同理化性质的固体脂质纳米粒在跨膜转运中所依赖的优势途径。
　　以单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯和山嵛酸甘油酯为脂质材料，以十八胺-异硫氰基荧光素(ODA-FITC)为荧光标记物，采用水性溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒。测定三种固体脂质纳米粒的粒径与电位，三种纳米粒粒径与电位相似。采用透射电镜直接观察固体脂质纳米粒的形态。用MDCK细胞作为模型细胞，用MTT的方法证明了固体脂质纳米粒具有生物安全性。用低温、不同的细胞摄取抑制剂和胞内转运抑制剂分别处理MDCK细胞以及细胞单层，考察三种固体脂质纳米粒在细胞中跨膜转运途径的差异。采用FRET技术观察固体脂质纳米粒在跨膜转运过程中的稳定性。利用细胞共定位实验分别观察三种固体脂质纳米粒在溶酶体、网格蛋白结构介导的囊泡、内质网和高尔基体中的分布情况。
　　研究发现三硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒的摄取量显著高于另两种纳米粒，利用低温将细胞主动转运过程抑制后，具有适中油水分配系数的三硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒摄取量最高。利用不同细胞摄取抑制剂处理细胞及细胞单层，可以观察到三硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒更依赖于经小窝蛋白/脂筏结构途径的摄取，山嵛酸甘油酯固体脂质纳米粒更依赖于网格蛋白结构介导途径的摄取。在MDCK细胞单层上的转运实验可以看出，三种固体脂质纳米粒的转运量之间没有显著性差异。低温抑制细胞单层膜的主动转运过程后，发现三硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒的转运量最高。胞内转运抑制剂处理细胞单层后，可以观察到三硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒更依赖于内质网到高尔基体途径的转运。FRET结果显示，固体脂质纳米粒在跨膜转运过程中稳定性均较好。共定位实验发现三硬脂酸甘油酯固体脂质纳米粒在内质网中的富集量最大。三种固体脂质纳米粒在溶酶体、囊泡、内质网、高尔基体中均有大量分布。
　　利用三硬脂酸甘油酯作为脂质材料，加入不同比例的PEG2000-SA进行亲水性修饰，水性溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒。考察三种固体脂质纳米粒的摄取量与跨膜转运量。用低温抑制主动转运过程的方法考察三种固体脂质纳米粒的细胞摄取量与跨膜转运量的差异。采用不同的细胞摄取抑制剂以及胞内转运抑制剂考察各个固体脂质纳米粒在细胞摄取及转运途径的差异。结果表明，PEG的修饰虽然会在一定程度上减小固体脂质纳米粒的摄取量，但一定量的PEG修饰可以增加固体脂质纳米粒在细胞单层上的转运量，研究转运机理可以发现，一定量的PEG修饰会减少固体脂质纳米粒在内质网中的量而增加其在高尔基体中的量从而增加转运量。本课题的研究有助于指导固体脂质纳米粒的处方设计与结构修饰，从而设计出能够高效进行跨膜转运的纳米载体。

目录

声明

致谢

摘要

引言

第一章 固体脂质纳米粒的制备及跨膜转运研究

1．1 实验材料与仪器

1．1．1 实验材料

1．1．2 仪器

1．2 实验方法

1．2．1 固体脂质纳米粒标记物的合成

1．2．2 水性溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒

1．2．3 固体脂质纳米粒理化性质研究

1．2．4 MDCK细胞的培养以及单层膜的构建

1．2．5 固体脂质纳米粒的毒性评价

1．2．6 固体脂质纳米粒在MDCK细胞上的摄取

1．2．7 固体脂质纳米粒在细胞单层上的转运量研究

1．2．8 外翻肠囊法考察三种固体脂质纳米粒的小肠转运吸收

1．3 结果与讨论

1．3．1 水性溶剂扩散法制备固体脂质纳米粒

1．3．2 透射电镜观察三种固体脂质纳米粒

1．3．3 固体脂质纳米粒的毒性评价

1．3．4 固体脂质纳米粒的定性及定量摄取

1．3．5 固体脂质纳米粒在细胞单层及离体小肠上的吸收转运量研究

1．4 本章小结

第二章 固体脂质纳米粒的理化性质与转运机制的关系

2．1 实验材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 固体脂质纳米粒的制备

2．2．2 MDcK细胞的培养以及单层膜的构建

2．2．3 固体脂质纳米粒摄取机制研究

2．2．4 固体脂质纳米粒与细胞器的共定位分析

2．2．5 固体脂质纳米粒与细胞共孵育的稳定性研究

2．2．6 固体脂质纳米粒在细胞单层膜上的转运

2．2．7 固体脂质纳米粒与内质网和高尔基体的共定位分析

2．2．8 FRET技术观察跨膜后固体脂质纳米粒的完整性

2．3 结果与讨论

2．3．1 三种固体脂质纳米粒摄取机制研究

2．3．2 固体脂质纳米粒与溶酶体和囊泡的共定位分析

2．3．3 固体脂质纳米粒在细胞中的稳定性研究

2．3．4 固体脂质纳米粒跨膜转运机制的研究

2．3．5 固体脂质纳米粒与内质网和高尔基体的共定位分析

2．3．6 FRET技术观察跨膜转运后的固体脂质纳米粒

2．4 本章小结

第三章 固体脂质纳米粒的PEG修饰与其转运规律的研究

3．1 实验材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 不同比例PEG修饰的固体脂质纳米粒的制备

3．2．2 MDcK细胞培养以及细胞单层的建立

3．2．3 不同修饰比例的固体脂质纳米粒细胞摄取量的比较

3．2．4 不同修饰比例的固体脂质纳米粒在细胞单层中的转运机制比较

3．3 结果与讨论

3．3．1 不同比例PEG修饰的固体脂质纳米粒的制各

3．3．2 不同比例PEG修饰的固体脂质纳米粒摄取量的比较

3．3．3 不同比例PEG修饰的固体月旨质纳米粒转运量的比较

3．4 本章小结

结论

参考文献

综述

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