猪伪狂犬病病毒Ⅱ型gE/TK双基因缺失株免疫原性研究

摘要

伪狂犬病又称奥耶斯基氏病(Pseudorabies，PR)，属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科成员，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的一类急性动物传染病，曾给世界多个国家的养殖业带来严重的损失。欧美等发达国家曾大规模使用基因标记疫苗配合区分野毒感染和疫苗免疫(Differentiating Infectedfrom Vaccinated Animals，DIAV)策略净化了该病毒，但目前该病仍然对我国养猪业危害较大。伪狂犬病病毒虽然具有广泛的宿主嗜性，可感染多种脊椎动物，并可在感染动物的体内建立潜伏感染，但以往认为该病毒对于人类无感染能力。而2018年3月初复旦大学附属中山医院的研究人员首次报导了伪狂犬病毒感染人的病例，因此PRV对于人类健康存在着一定的威胁。
　　2011年之后，我国多个已免疫Bratha株疫苗的猪场出现伪狂犬病疫情，新的变异株被分离鉴定，多个团队报道传统的Bratha株疫苗已无法提供完全的保护力，PRV变异株的出现严重威胁着我国养猪业健康发展，研发新型猪伪狂犬病毒疫苗的需求已经迫在眉睫。
　　本研究利用实验室构建的gE/TK双基因缺失株（PRV HD/c株），通过将该毒株灭活，并筛选合适的佐剂，制备成灭活苗，进行安全性、免疫原性的系统探究。结果显示，小鼠腹腔双倍剂量免疫后无应激表现，仅存在短暂一过性体重下降，48小时后即可恢复;小鼠腹腔接种后7天疫苗可完全吸收，无腹水产生及其他相关病理学变化;同样，仔猪接种无应激变化，注射部位未见病理学变化，也表现出良好的安全性。
　　单剂量灭活苗免疫小鼠和断奶仔猪，免疫后21天后可抵御致死剂量PRV变异株和国内传统PRV毒株的攻击，且单剂量免疫效果优于Bartha K61株灭活疫苗仔猪，该灭活苗可为免疫猪提供5个月以上的有效保护期。仔猪单剂量免疫后最早7天gB抗体转阳，并可持续150天以上，免疫后21天中和抗体水平可达到高峰;对攻毒后仍存活的仔猪进行剖检和病理学检测，发现免疫组仔猪脑、肝、肺和扁桃体等脏器无显著病理学变化。妊娠母猪二次免疫后所生仔猪28日龄时可检测到高滴度母源抗体，并可完全抵御致死量PRV变异株的攻击。
　　为进一步探究PRV HD/c株作为候选弱毒苗的潜力，我们对PRV HD/c减毒株作为弱毒苗的安全性和免疫保护力进行探究。结果显示PRV HD/c减毒株在小鼠模型和仔猪模型中的安全性良好:小鼠10倍剂量腹腔接种不发病，无粪便排毒，不影响3周龄BALB/c小鼠的体重增长，14日龄仔猪接种同样不引起发病，精神状况和食欲良好。PRV HD/c株小鼠免疫后(107TCID50)10天攻毒，最高可获得100％的保护率。同样，14日龄仔猪免疫后21天攻毒仍可取得100％的保护。
　　第二章 猪伪狂犬病病毒Ⅱ型双基因缺失株灭活抗原免疫原性测定
　　本研究通过筛选佐剂，将经灭活处理的伪狂犬病病毒gE/TK双基因缺失株（PRV HD/c株）乳化制备成灭活疫苗，以小鼠、猪为模型动物，对其安全性和免疫原性以及灭活苗理化特性进行系统评估。安全性实验表明:小鼠和仔猪双倍剂量接种无应激表现，吸收良好，接种部位剖检无病理学变化。免疫保护实验表明:小鼠和仔猪单剂量免疫效果优于Bartha K61株疫苗，免疫后21天后可完全抵御致死量的伪狂犬变异株和国内传统强毒株的攻击。仔猪免疫后最早7天gB抗体转阳，单剂量免疫可为仔猪提供5个月以上的有效保护期;母源抗体实验表明，怀孕母猪二次免疫后所生仔猪28日龄进行攻毒，可抵御致死量变异株的攻击。疫苗保存期实验表明该灭活苗于4℃稳定存放一年以上，理化特性较稳定。
　　第三章 猪伪狂犬病病毒Ⅱ型gE/TK双基因缺失减毒株免疫原性测定
　　灭活苗和减毒苗是疫苗研制的两种不同策略，通过对于PRV HD/c减毒株安全性和免疫保护实验评估了PRV HD/c减毒株作为弱毒苗候选株的潜力。实验结果表明该减毒株具有良好的安全性，小鼠和仔猪接种减毒株后无伪狂犬发病症状，采食和精神状况良好，3周龄小鼠接种后体重变化与mock小鼠无显著差异，10倍剂量接种后14天内无排毒现象，具有良好的安全性。
　　PRV HD/c减毒株免疫保护效果具有明显的剂量依赖效应。单剂量免疫后可建立有效的主动免疫保护，小鼠免疫后(107TCID50)第10天对于绝对致死量病毒攻击即可获得90％-100％的保护率。同样，单剂量免疫14日龄仔猪同样可抵御致死量病毒的攻击，并产生高滴度的血清中和抗体和PRV特异性抗体。因此，PRV HD/c株具有望作为预防PRV变异株的新型候选弱毒苗。

目录

声明

论文说明

论文创新点

摘要

第一章 伪狂犬病病毒分子生物学特性及其疫苗研究进展

1．2 伪狂犬病病毒结构特征

1．3 伪狂犬病病毒基因组编码的蛋白质

2 伪狂犬病的临床症状及病理变化

3 伪狂犬病的流行情况

4 伪狂犬病的疫苗研究进展

4．1 基因缺失弱毒苗

4．2 亚单位疫苗

4．3 重组病毒疫苗

第二章 猪伪狂犬病病毒Ⅱ型双基因缺失株灭活抗原免疫原性测定

1 材料与方法

1．1 病毒、细胞与疫苗

1．2 试剂与耗材

1．3 主要仪器

1．4 PRV gE／TK双基因缺失株复制特点和遗传稳定性研究

1．5 佐剂筛选

1．6 免疫安全性实验

1．7 小鼠免疫保护实验

1．8 仔猪免疫保护模型建立

1．9 仔猪免疫交叉攻毒实验

1．10 免疫保护期实验

1．11 母源抗体保护效果评估

1．12 灭活苗保质期实验

2 结果

2．1 PRV gE／TK双基因缺失株复制特点和遗传稳定性研究

2．2 佐剂筛选

2．3 灭活苗免疫安全性实验

2．4 小鼠免疫交叉攻毒实验

2．5 仔猪免疫保护模型建立

2．7 仔猪交叉攻毒保护实验

2．8 免疫保护期测定

2．9 母源抗体保护效果评估

2．10 疫苗保质期检测

3 讨论

第三章 猪伪狂犬病病毒Ⅱ型gE／TK双基因缺失减毒株免疫原性测定

1 材料与方法

1．1 病毒、细胞与疫苗

1．2 试剂与耗材

1．3 主要仪器

1．4 PRV Ⅱ型gE／TK双缺减毒株小鼠免疫保护模型的构建

1．5 免疫安全性实验

1．6 小鼠免疫交叉攻毒实验

1．7 PRVⅡ型gE／TK双缺减毒株仔猪免疫保护效果评估

2 结果

2．1 PRV gE／TK双缺减毒株小鼠免疫保护模型的构建

2．2 免疫安全性实验

2．3 PRV Ⅱ型gE／TK双基因缺失减毒株仔猪免疫保护效果评估

3 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢