新型小檗胺衍生物4--氯苯甲酰小檗胺在c--Myc表达阳性弥漫大B细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用及其机制研究

摘要

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B cell Lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)中所占比例最高的一种B细胞淋巴瘤。近年来，利妥昔单抗和自体干细胞移植等新治疗措施的应用明显改善了DLBCL的疗效，但仍有约40％的DLBCL病例进展为复发难治。由于c-Myc蛋白具有半衰期短、代谢快以及其自身特殊bHLHZ(carboxy-terminal basic-helix-loop-helix-zipper)结构药物不易结合等特点，目前尚无有效的靶向治疗药物，被认为是最引人注目的抗肿瘤靶点之一。 小檗胺(Berbamine)是一种天然植物提取结构特殊的双苄基异喹啉类生物碱药物，它作为一种免疫调节剂在国内临床应用多年。前期研究发现Berbamine对急慢性白血病、骨髓瘤、黑色素瘤、肝癌等多种肿瘤均具有抑制作用，但因治疗浓度较高阻碍了其临床应用。 本课题首先对c-Myc表达阳性DLBCL病例进行临床分析，观察c-Myc表达阳性DLBCL的临床特点、治疗效果及对生存影响;同时，评价CBBM是否对c-Myc表达阳性DLBCL具有抗肿瘤作用并初步探讨其机制，为c-Myc表达阳性DLBCL的靶向性治疗提供新的思路。本文主要分为以下几个部分: 第一部分c-Myc表达阳性在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中临床意义研究：116例初发弥漫大B细胞淋巴瘤病例临床分析 目的： 通过分析c-Myc表达阳性DLBCL的发生率、临床特点、治疗疗效以及对预后的影响，明确以c-Myc作为靶点对DLBCL的价值和意义。 方法： 回顾性分析2015年-2018年经浙江大学医学院附属XX血液科和浙江大学医学院附属XXX血液科治疗、病史资料完备的116例DLBCL病例，利用免疫组化的方法检测福尔马林固定石蜡包埋标本中c-Myc、BCL2、CD10、BCL6、MUM1、Ki-67的表达情况，分析c-Myc表达阳性与患者年龄、临床分期、国际预后指数评分(International Prognostic Index，IPI)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、GCB/non-GCB亚型、Ki-67增殖指数、中枢神经系统浸润、胃肠道浸润、对治疗反应和总生存(Overall Survival，OS)的关系。 结果： 1.116例初发DLBCL患者中c-Myc表达阳性比例约占40.52％(47/116)，其中c-Myc高表达(＞80％)占6.90％(8/116)，c-Myc和BCL2双阳性表达比例占34.48％(40/116)。 2.与c-Myc表达阴性患者相比，c-Myc表达阳性DLBCL IPI评分较高（年龄大于60岁组）(p=0.033)、Ki-67指数倾向高增殖活性(＞80％)(p=0.002)、更易发生中枢神经系统浸润(p=0.003)，而六个疗程后的完全缓解率(Complete rsaponse，CR)更低(p=0.028)。 3.c-Myc表达阳性DLBCL患者中位生存时间为23个月，c-Myc表达阴性DLBCL患者中位时间未达到(p=0.005);c-Myc、BCL2双阳性表达DLBCL患者中位生存时间为23个月，而其他组中位生存时间未达到(p=0.004)。 结论： c-Myc表达阳性DLBCL患者表现为更具侵袭性的临床特点，对治疗的反应更差;c-Myc表达阳性和c-Myc、BCL2双阳性表达是影响DLBCL患者OS的不良预后因素。 第二部分CBBM体外抑制c-Myc表达阳性弥漫大B细胞淋巴瘤细胞增殖及其机制研究 目的： 通过比较Berbamine及其衍生物CBBM对DLBCL细胞增殖活性的抑制作用，观察不同浓度CBBM对DLBCL细胞凋亡诱导和周期阻滞影响，评价CBBM作为一种新的小分子抑制剂在DLBCL中的抗肿瘤潜能;通过观察CBBM对OCI-Ly3细胞c-Myc及其相关蛋白表达、自分泌白介素10(Interleukin10，IL10)及其下游JAK2/STAT3信号转导通路的影响，明确CBBM抑制c-Myc表达阳性DLBCL细胞可能的分子机制。 方法： 1.应用MTT方法检测Berbamine及其新型衍生物CBBM对OCI-Ly3、OCI-Ly10、U2932、SU-DHL16和Pfeiffer五种DLBCL细胞系的增殖抑制作用;同样方法检测CBBM对两例健康供者外周血干细胞的增殖抑制影响，评价CBBM对正常血细胞的毒性作用。 2.应用流式细胞术检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后凋亡细胞数量的变化和细胞周期分布情况。 3.采用Western Blot技术检测不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞前后Caspase3、Cleaved-Caspase3、PARP、Cleaved-PARP、LC3B等凋亡和自噬相关蛋白的表达变化。 结果： 1.CBBM对OCI-Ly3、OCI-Ly10、U2932、SU-DHL16和Pfeiffer五种DLBCL细胞系24h的IC50值分别为1.39±0.04、2.56±0.04、3.89±0.07、1.82±0.05、3.73±0.06μmol/L，分别是Berbamine的8.78±0.25、9.24±0.33、4.57±0.017、9.64±0.53和7.01±0.031倍;CBBM10μmol/L高浓度作用下，对外周血干细胞的增殖并无明显抑制作用，存活率分别为87.93±4.70％和93.15±1.50％。CBBM对OCI-Ly3细胞的选择指数为7.20±0.22。 2.凋亡分析发现经CBBM处理的OCI-Ly3细胞凋亡细胞数明显增加。而细胞周期分析表明经CBBM处理的OCI-Ly3细胞G0/G1期的细胞明显增加，S期、G2/M期数量明显减少。两种变化均随着药物浓度的升高更显著。 3.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后，与对照组相比，总的Caspase3、PARP无明显变化，Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、LC-3B表达量明显增加。 4.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后，与对照组相比，c-Myc mRNA水平和蛋白水平均下降，蛋白下降更明显。4μmol/L CBBM联合MG132组作用OCI-Ly3细胞6h后c-Myc蛋白水平较CBBM组有一定程度的回升。 5.通过分析CBBM对五种细胞的IC50值和CaMKⅡγ的表达灰度值相关性发现两者具有显著相关性，R2=0.8269。经CBBM作用后OCI-Ly3细胞phosphate-CaMKⅡγ和CaMKⅡγ蛋白表达明显下降。 6.低浓度CBBM作用OCI-Ly3细胞后，与对照组相比，自分泌IL10水平明显下降，其中48h组1μmol/L、2μmol/L CBBM处理后分别由66.02±0.33pg/mL降至38.99±0.57pg/mL、26.67±0.47pg/mL。 7.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后，与对照组相比，phosphate-JAK2和phosphate-STAT3的表达明显下降，而检测其下游分子BCL2蛋白也发现明显下降。 8.外源性重组人IL10可以增强phosphate-STAT3和c-Myc的表达。而CBBM能显著降低IL10引起的phosphate-STAT3、c-Myc、BCL2表达增高。 9.不同浓度CBBM处理OCI-Ly3细胞24h后，与对照组相比，c-Myc下游分子PD-L1表达明显下降，CBBM联合MG132组作用OCI-Ly3细胞PD-L1蛋白水平未见上升。 结论： 1.CBBM和Berbamine对DLBCL细胞均有增殖抑制作用，但CBBM比Berbamine具有更强的抗淋巴瘤活性。同时，CBBM选择性抑制DLBCL细胞的增殖，对外周血干细胞无明显毒性。 2.CBBM阻止细胞进入细胞周期，通过激活细胞内凋亡和自噬相关蛋白诱导OCI-Ly3细胞凋亡。 3.CBBM在mRNA水平和蛋白水平均可抑制OCI-Ly3细胞c-Myc的表达。其中对c-Myc蛋白水平的抑制更明显。这种抑制是可能通过蛋白酶体途径实现的，对c-Myc稳定因子CaMKⅡγ及其磷酸化的抑制也可能是其机制之一。 4.CBBM可以抑制OCI-Ly3细胞自分泌IL10的水平，但并不影响IL10mRNA的变化。CBBM通过抑制OCI-Ly3细胞自分泌IL10来调控JAK2/STAT3信号转导通路、c-Myc和BCL2的表达。 5.CBBM可抑制c-Myc下游分子PD-L1的表达。

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摘要

英文缩略语索引

前言

第一部分c-Myc表达阳性在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中临床意义研究：116例初发弥漫大B细胞淋巴瘤病例临床分析

1．1引言

1．2材料和方法

1．3结果

1．4讨论

1．5小结

第二部分CBBM体外抑制c-Myc表达阳性弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的增殖及其机制研究

2．1引言

2．2材料与方法

2．3结果

2．4讨论

2．5小结

结论

参考文献

综述 c-Myc表达阳性在弥漫大B细胞淋巴瘤中的意义

作者简历