乳酸杆菌γ-氨基丁酸合成能力的强化研究

摘要

作为哺乳动物中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，γ-氨基丁酸(GABA)具有降血压、健肝利肾、增强记忆、促进睡眠等多种生理功能，在食品、医药、化工等行业具有广泛用途。通过乳酸菌发酵生产GABA以满足其日益增长的商业需求是人们的普遍共识，了解乳酸菌谷氨酸脱羧酶(GAD)系统基因表达情况，并通过代谢工程、蛋白质工程和发酵调控等手段提升乳酸菌GABA生产性能具有重要意义。本研究首先以GABA高产菌株Lactobacillusbrevis CGMCC1306为研究对象，解析了在不同培养条件下菌株GAD系统关键基因的表达差异;其次，克隆了植物乳杆菌Lactobacillus plantarum GAD（具有相对较宽pH催化活性范围）基因并对其进行分子改造，获得了在近中性pH条件下仍具有较高催化活性的突变体GadB C378S，并将该突变酶在Lb.brevisCGMCC1306中过表达，提高了菌株的GABA合成能力。论文主要研究结果如下:
　　(1)以Lb.brevis CGMCC1306为研究对象，在外源添加二环己基碳二亚胺(DCCD)弱化细胞F1FO-ATPase酶活的情况下，考察菌体生长代谢情况和其GAD系统中关键基因gadA、gadB和gadC的转录水平。结果表明:不同程度弱化F1FO-ATPase活性会导致该菌菌体生长受到不同程度的抑制，且高浓度DCCD会导致细胞裂解死亡;采用低浓度的DCCD适当抑制F1FO-ATPase酶活可以加快Lb.brevis CGMCC1306在兼性厌氧条件下细胞内的糖酵解速率，并提高GAD系统关键基因gadB和gadC的表达水平（对数后期时较对照组分别提高25.09％和37.65％;稳定期时较对照组分别提高11.03％和32.5％），从而提高菌体细胞的GABA合成速率。
　　(2)以获取具有相对较宽pH催化活性范围的Lb.plantarum GAD(GadB)为目标，采用溶钙圈法和目的基因PCR筛选法获得了两株具有GABA合成能力的植物乳杆菌Lb.plantarum GM1403与Lb.plantarum PF1409，然后克隆了这2个菌株的gadB基因，并以pET28a表达载体，分别在E.coli BL21(DE3)中进行了重组表达研究，实现了2个酶的可溶性表达。在此基础上，考察了这两个酶的酶学性质，发现两种酶最适温度和pH相同（分别为40℃和pH5.0），但是来源于这两个菌株的GadB具有更宽广的pH催化范围:当pH值升高至5.6时，不仅仍具有催化活性，而且相对酶活高达34.5％，远高于其它乳酸菌源的GAD相对酶活。
　　(3)为进一步提高Lb.plantarum GM1403 GadB在中性条件下的催化活力，本研究构建了截短C末端的GadBΔ11突变体并通过定向进化的方法获得了该突变体的突变文库，利用建立的高通量筛选法（基于pH敏感指示剂甲酚红的比色法），在近中性条件下筛选获得了一个较好的突变体C378S:该突变体在pH值为6和7时，酶活性分别是GadBΔ11的1.48倍和2.03倍。在最适反应条件下(pH5.0，40℃)，C378S的Km为19.03 mM，且与GadBΔ11相似。在Lb.brevis CGMCC1306中，利用乳酸菌组成型表达载体pMG36e对突变体C378S进行异源过表达，结果表明重组菌株Lb.brevis/pMG36e-gadBc378s经过36 h发酵，GABA的产量可以达到38.47 g/L，较对照组的产量提升了24％。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 绪论

1．1．1 γ-氨基丁酸(GABA)的结构与性质

1．1．2 GABA的生理功能

1．1．3 GABA的应用

1．1．4 GABA的制备

1．2 乳酸菌概述

1．2．1 乳酸茵及其应用

1．2．2 乳酸菌面临的环境胁迫

1．2．3 乳酸菌抵御酸胁迫的耐受及响应机制

1．3 乳酸茵合成GABA的研究

1．3．1 乳酸茵GAD系统关键蛋白

1．3．2 提升乳酸菌GABA合成能力的研究

1．4 本论文主要研究内容

1．4．1 研究背景及意义

1．4．2 主要研究内容

第二章 不同培养条件下短乳杆菌GAD系统关键基因的表达

2．1 前言

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 菌种与试剂

2．2．2 仪器

2．2．3 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 常用试剂配制

2．3．2 发酵培养方法

2．3．3 荧光定量PCR测定目的基因的转录情况

2．3．4 弱化F1Fo-ATPase活性对短乳杆菌合成GABA的影响

2．4 结果讨论

2．4．1 好氧条件下短乳杆菌GAD系统的转录表达

2．4．2 兼性厌氧条件下短乳杆菌GAD系统的转录表达

2．4．3 F1Fo-ATPase抑制剂DCCD对短乳杆菌细胞生长的影响

2．4．4 兼性厌氧培养条件下DCCD对短乳杆菌GAD关键酶的转录表达情况

2．5 本章小结

第三章 植物乳杆菌源谷氨酸脱羧酶的筛选及酶学性质分析

3．1 前言

3．2 实验材料与仪器

3．2．1 菌种、质粒与试剂

3．2．2 仪器

3．2．3 细菌培养基

3．2．4 菌种生理生化鉴定培养基

3．3 实验方法

3．3．1 常用试剂配制

3．3．2 菌种分离、纯化和保存

3．3．3 发酵培养方法

3．3．4 菌株16S rRNA分子生物学鉴定

3．3．5 植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆

3．3．6 大肠杆菌质粒提取

3．3．7 大肠杆菌电转化感受态细胞的制备

3．3．8 大肠杆菌电击转化

3．3．9 大肠杆菌重组菌株的构建

3．3．10 重组大肠杆菌的诱导表达

3．3．11 重组GAD的纯化

3．3．12 重组GAD酶学催化特性分析

3．3．13 重组GAD蛋白分子量分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 产GABA植物乳杆菌的分离

3．4．2 生理生化特性

3．4．3 菌株16S rRNA基因系统发育学分析

3．4．4 植物乳杆菌GadB序列特征

3．4．5 植物乳杆菌GadB表达纯化

3．4．6 植物乳杆菌GadB分子量测定

3．4．7 植物乳杆菌GadB同源模拟

3．4．8 植物乳杆菌GadB活性中心特征

3．4．9 植物乳杆菌GadB的分子对接

3．4．10 植物乳杆菌GadB酶学催化特性分析

3．5 本章小结

第四章 定向进化谷氨酸脱羧酶提升短乳杆菌GABA合成效率

4．1 前言

4．2 实验材料与仪器

4．2．1 质粒与菌种

4．2．2 试剂

4．2．3 仪器

4．2．4 培养基

4．3 实验方法

4．3．1 易错PCR构建gadB突变体文库

4．3．2 pET28a(+)-GadBΔ11突变体的诱导表达

4．3．3 基于pH敏感指示剂比色法的高GAD活性菌株高通量筛选方法建立

4．3．4 GadBΔ11及突变体的表达和纯化

4．3．5 蛋白酶的SDS-PAGE凝胶电泳

4．3．6 考马斯亮蓝法测定蛋白含量

4．3．7 突变酶GAD活性的测定

4．3．8 pH对突变体GAD酶活性的影响

4．3．9 温度对突变体GAD酶活性的影响

4．3．10 GadB突变体动力学参数的测定

4．3．11 重组短乳杆菌pMG36e-GadBΔ11的构建

4．3．12 重组短乳杆菌的发酵培养

4．3．13 短乳杆菌GAD活性的测定

4．4 结果讨论

4．4．1 C末端截短GadB及其突变体文库构建

4．4．2 基于pH敏感指示剂比色法的高通量筛选法的建立

4．4．3 突变文库的鉴定

4．4．4 pH对C378S突变体酶活的影响

4．4．5 温度对C378S突变体GAD酶活的影响

4．4．6 C378S突变体动力学参数的测定

4．4．7 重组表达c末端截短的GadB突变体提升短乳杆菌GAD活性

4．4．8 重组表达C378S提升短乳杆菌GABA合成性能

4．5 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献