外向转运蛋白对重组大肠杆菌5--氨基乙酰丙酸发酵的影响

摘要

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid），简称ALA，是一种广泛存在于生物体代谢过程中的非蛋白类氨基酸。ALA是各种生物体内四吡咯类化合物合成的共同前体，由于其特有的光化学活性，在农业和医学领域有巨大的应用价值。相对于化学合成法，生物发酵法生产ALA能够大幅降低成本，受到广泛关注。在ALA生产菌中，随着胞内ALA浓度的不断提高，其下游四吡咯类化合物合成速率也随之增加，也即ALA的消耗速率增加，不利于ALA的进一步积累。若能及时地将ALA转运至胞外，使胞内ALA的含量保持在较低的水平，就能降低ALA的消耗。尽管目前还未发现ALA的特异性外向转运蛋白，但细胞内一些氨基酸等小分子的结构和ALA有一定的相似性，且这些小分子的特异性外向转运蛋白已经有文献报道，研究这些外向转运蛋白对ALA的转运作用，从中筛选有利于重组大肠杆菌发酵生产ALA的转运蛋白，是本文的主要研究目标。 首先根据文献资料，从细菌中选择并克隆了16种外向转运蛋白，分别构建了相应的过表达菌株。在优化后的摇瓶培养基中培养，比较了过表达不同外向转运蛋白对ALA胞外积累的影响，发现rhtA基因过表达使ALA胞外积累量提高了10.5％，达到1.73g·L-1。接着，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将宿主中rhtA基因敲除，探究各基因在rhtA基因敲除的宿主中过表达对ALA胞外积累的影响，发现rhtA，rhtB，rhtC和yeeO基因的过表达能提高重组菌株胞外ALA的积累量，其中rhtA基因过表达时ALA胞外积累量比基因敲除菌株提高12.5％。 鉴于ALA在高温和碱性环境中稳定性较差，为了及时、准确测定胞内ALA浓度，选择了液氮冻融与盐酸浸泡结合的方式破碎细胞，取得了较好的效果。 针对筛选得到的4种促进ALA胞外积累的转运蛋白，分别构建基因敲除菌株以及过表达菌株。通过测定细胞内外ALA浓度差异，分析它们对ALA外转运的影响，结果显示，过表达外向转运蛋白RhtA能提高胞外ALA浓度，并显著降低重组菌株的胞内ALA浓度，在对照组胞内浓度达到最高时，该重组菌株胞内浓度只有对照组的10％。但是过表达外向转运蛋白RhtB，RhtC以及YeeO对ALA的胞内外浓度影响较小。由结果可以推测，只有外向转运蛋白RhtA能通过高效转运ALA至胞外，从而增加产量。 最后，在20L发酵罐中进行补料发酵，结果表明E.coli W3110(DE3)-hemA-rhtA菌株ALA产量比E.coli W3110(DE3)-hemA菌株提高了29.4％，达到13.68g·L-1。

目录

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致谢

摘要

1．1引言

1．2 5-氨基乙酰丙酸的应用与市场前景

1．2．1 5-氨基乙酰丙酸在农业上的应用

1．2．2 5-氨基乙酰丙酸在医学上的运用

1．3 ALA的生产方法

1．3．1 5-氨基乙酰丙酸的生产

1．3．2化学法合成ALA

1．3．5代谢改造构建5-氨基乙酰丙酸高产菌株

1．3．6与5-氨基乙酰丙酸合成相关基因的修饰与改造

1．3．7 5-氨基乙酰丙酸下游代谢途径的改造与调控

1．3．8对整体代谢流调控优化促进ALA合成

1．3．9降低胞内ALA浓度

1．3．10其他策略提高ALA产量

1．3．11未来ALA高产菌株的研究方向

1．4膜转运蛋白

1．4．1小分子化合物外向转运蛋白

1．4．2细菌中的氨基酸外向转运蛋白

1．4．3 ALA外向转运蛋白研究现状

1．4．4 ALA底物类似物的外向转运蛋白及其应用

1．5本研究工作思路

2．1引言

2．2材料和方法

2．2．1质粒与菌株

2．2．2培养基配制及使用

2．2．3菌种培养方法

2．2．4酶与试剂盒

2．2．5大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白的提取

2．2．6 ALA化学显色法检测浓度

2．2．7 SDS-PAGE蛋白电泳

2．2．8重组质粒及菌株的构建

2．2．9重组连接构建重组质粒

2．2．10 hemA基因表达

2．2．11培养条件优化

2．3结果与讨论

2．3．2质粒上的His标签对hemA基因表达的影响

2．3．3重组质粒的构建

2．3．4 LB培养基与摇瓶培养基对ALA积累的影响

2．3．5诱导剂IPTG添加量对ALA积累的影响

2．3．6诱导温度对对ALA积累的影响

2．4小结

第三章基因的初步筛选及ALA的胞内检测

3．2．1质粒与菌株

3．2．2菌株培养条件

3．2．3 CRISPR／Cas9基因敲除技术

3．2．4电击转化感受态

3．2．5菌体收集与预处理

3．2．6超声破碎破胞法

3．2．7煮沸破胞法

3．2．8液氮冻融破胞法

3．3结果与讨论

3．3．1各基因过表达对细胞生长和细胞外ALA积累量的影响

3．3．2rhtA基因敲除菌株的构建

3．3．3过表达各基因对rhtA敲除菌株ALA产量的影响

3．3．4胞内ALA测定方法的确定

3．3．5盐酸浓度对破胞效率的影响

3．3．6盐酸浸泡时问对破胞效率的影响

3．3．7盐酸浸泡温度对破胞效率的影响

3．4小结

第四章外向转运蛋白在基因敲除菌株中对ALA分泌的影响

4．1引言

4．2材料与方法

4．2．1 rhtCB与yeeO基因敲除

4．2．2基因敲除重组菌株摇瓶实验

4．2．3rhtA基因敲除的重组菌株之间细胞内外ALA浓度变化曲线

4．2．4 rhtCB基因敲除的重组菌株之间细胞内外ALA浓度变化曲线

4．2．5yeeO基因敲除的重组菌株之间细胞内外ALA浓度变化曲线

4．2．6 ALA高效液相色谱法检测浓度

4．2．7补料发酵培养验证过表达RhtA对重组菌株产量的影响

4．3结果与讨论

4．3．1 rhtCB基因与yeeO基因敲除菌株的构建

4．3．2rhtA基因对重组菌株分泌ALA的影响

4．3．3 rhtCB基因对重组菌株分泌ALA的影响

4．3．4 yeeO基因对重组菌株分泌ALA的影响

4．3．5rhtA基因在重组菌株发酵培养中对ALA产量的影响

4．4小结

第五章结论与展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

附录

作者简介