发育时期Disabled--1可变性剪接调控神经元迁移的研究

摘要

皮层发育过程中，神经元迁移是分层结构的基础。在多种复杂的迁移行为中，多极向双极过渡（multipolar-to-bipolar transition，MBT）是神经元精确迁移与精准定位的关键。Reelin-Disabled-1(Dab1)信号通路在调控神经元迁移中至关重要，然而，Dab1分子如何协同介导下游分子，最终影响多极向双极过渡，仍然是悬而未决的问题。此前，曾发现，Dab1基因通过可变性剪接(alternative splicing)，能够产生多种迥异的剪接体(isoforms)，分别携带不同的酪氨酸结构域，招募不同的下游效应分子。本次工作，在发育过程的皮层中揭示Dab1基因经由外显子7、外显子8和外显子9bc的可变性剪接可以动态调节酪氨酸结构域的组装与活性。不同发育时相胚胎鼠皮层原位杂交（in situ hybridization，ISH）和荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）结果显示，Dab1可变性剪接具备时间空间特异性，主要发生于胚胎期14.5天(E14.5)的多极神经元聚集区(multipolar accumulation zone，MAZ)。借助子宫内胚胎电转染（in utero electroporation，IUE）技术，向皮层迁移神经元外源表达不同的Dab1剪接体，发现缺失外显子7和/或外显子8，或者冗余外显子9bc的Dab1剪接体均削弱了Dab1酪氨酸磷酸化激活水平，阻滞导向突起(leading process)的延伸，使多极神经元丢失迁移指向，大量滞留在多极神经元聚集区，最终引发迁移紊乱。另外，在Dab1基因敲除（Dab1knock-out，Dab1KO）的小鼠皮层神经元中，外源引入典型Dab1剪接体有助于MBT的完成，继而挽救因Dab1敲除导致的迁移紊乱。但引入缺失外显子7和外显子8，或冗余外显子9bc的剪接体却丧失了挽救神经元迁移紊乱的能力。由于以上外显子直接编码酪氨酸磷酸化基序(motif)，因此，可变性剪接可以通过Dab1剪接体的磷酸化激活状态的切换，间接介导皮层神经元多极向双极过渡，实现对迁移的精确调控。此次研究，揭示了Dab1基因可变性剪接是协调神经元多极向双极过渡和迁移的时空特异性调控的关键机制。

目录

声明

致谢

摘要

第1章引言

第2章方法和材料

2．1实验动物和来源

2．2试剂

2．3抗体

2．4质粒

2．5子宫内胚胎电转染

2．6灌流与切片

2．7组织化学染色

2．8原位杂交

2．9成像与分析

2．10皮层分层统计和神经元重构形态分析

2．11荧光实时定量PCR(RT-qPCR)

2．12 PCR分析剪接体分布(PCR analysis of Dab1 isoforms)

2．13统计分析

第3章实验结果

3．1 Disabled-1外显子7、8和9bc可变性剪接发生在神经元迁移时期

3．2 Dab1各种剪接体的表达引起神经元在皮层板中不同的定位

3．3 Dab1可变性剪接协调多极神经元聚集区的多极向双极过渡

3．4多极神经元聚集区是Dab1-can剪接体酪氨酸磷酸化的中心

3．5不同剪接体对Dab1敲除引起的迁移紊乱的挽救效应各有差异

第4章结果讨论

4．3 Dab1基因外显子7和外显子8对神经元迁移至为重要

4．4 Dab1可变性剪接操纵了神经元迁移的“开关”

4．6神经元正常迁移需要众多Dab1剪接体的协同合作

4．7 Dab1酪氨酸磷酸化位点的切换动态调控神经元迁移过程

4．8工作模型阐释

4．9总结

参考文献

第6章文献综述

作者简历及在读期间所获得的科研成果