嵌有载药胶束的间充质干细胞生物靶向系统的构建及对脑胶质瘤的治疗研究

摘要

肿瘤靶向治疗是新型给药系统研究领域的一大命题，靶向系统可提高肿瘤组织的药物浓度、增强药效，同时降低毒副作用。除了使用传统的纳米靶向制剂，还可以通过生物载体实现药物的递送。间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSCs)是一类具有肿瘤趋向特性的成体干细胞，在细胞治疗、组织再生和免疫治疗等方面有广泛的应用。将MSCs作为药物载体，可实现肿瘤的靶向治疗。本文以MSCs与肿瘤细胞表面共表达受体CD44为着眼点，合成了透明质酸-b-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(HA-b-PLGA)聚合物，以该聚合物作为载体，制备了载有紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的PTX-HA-PLGA胶束。通过细胞内吞方式将胶束载入MSCs中，构建出嵌有载药胶束的MSCs生物靶向系统(MSCs-Micelles)。该系统通过CD44介导的内吞增加了MSCs的载药量，同时胶束包裹避免了药物与MSCs的直接接触，降低PTX对MSCs的毒性，维持了MSCs的肿瘤归巢能力。脑对侧半球注射后，在脑胶质瘤区域可观察到MSCs和药物的广泛分布。通过增加PTX从MSCs中释放的总量和释放时间，MSCs-Micelles提高了递送至肿瘤细胞内药物的浓度，增强了抗肿瘤活性，显著延长了脑胶质瘤原位移植模型大鼠的生存期。 为了制备聚合物胶束，本文首先合成了三种不同分子量的HA-b-PLGA502H聚合物(HA分子量分别为5.8，6.7，9.1 kDa)。通过还原胺化法在HA末端连接1，4-丁二胺，使其与PLGA琥珀酰亚胺酯反应缩合生成HA-b-PLGA聚合物，使用1H-NMR和GPC对聚合物进行结构确证。采用芘荧光探针光谱法测定HA-b-PLGA聚合物的临界胶束浓度(Critical micelle concentration，CMC)。结果表明CMC值随着HA分子量的增大而增大，HA5.8k-b-PLGA，HA6.7k-b-PLGA和HA9.1k-b-PLGA对应的CMC分别是1.42 mg/L，2.08 mg/L和2.84 mg/L。采用溶剂-透析法制备HA-PLGA空白胶束，胶束粒径随HA分子量增加而变大，zeta电位均保持在-15.0 mV～-16.0 mV之间。本文选用具有小粒径且低CMC值的HA5.8k-b-PLGA502H制备PTX-HA-PLGA胶束，用于后续的MSCs-Micelles系统的构建。为获得较高的包封率和载药量，我们对聚合物浓度和PTX/聚合物比例进行筛选，最终确定以2 mg/mL的共聚物浓度，PTX/聚合物比例为1∶20的最优处方来制备PTX-HA-PLGA胶束。透射电镜(TEM)可观察到聚合物胶束经典的核-壳结构，采用HPLC测定其包封率达53.64±1.08％，载药量为2.57±0.03％。体外释放实验表明胶束具有缓释效果，3天可累积释放超过50％。 MTT法考察载药胶束对MSCs和大鼠C6脑胶质瘤细胞的细胞毒性。结果表明两种细胞对PTX的敏感性存在显著差异，HA-PLGA-PTX胶束对MSCs的IC50（1226.81±20.53 ng/mL）显著高于C6细胞（3.8±0.14 ng/mL），两者相差300多倍，有利于MSCs在安全范围内携载和递送药物至C6细胞，并产生抗肿瘤活性。与PTX溶液组相比，胶束包裹可有效避免MSCs与PTX的接触，增加了MSCs对PTX的耐受性，有利于提高MSCs的载药量。以6-香豆素作为荧光探针，对MSCs的胶束摄取情况和摄取机制进行考察。饱和摄取及内吞抑制实验表明MSCs通过CD44介导的内吞提高对胶束的摄取，并通过网格蛋白介导和小窝蛋白依赖性的内吞途径参与内化过程。本文考察了与不同浓度的载药胶束孵育后，MSCs细胞周期和体外细胞迁移能力的变化。实验发现，在中剂量组，MSCs分别在撤药3天和5天后恢复细胞迁移能力和细胞周期，确定MSCs与8 ng/mL载药胶束孵育8小时用于后续MSCs-Micelles的构建，该生物系统载药量为1.3 pg PTX/cell。随后我们对MSCs-Micelles的体外释放行为进行了评价。结果表明MSCs释放药物呈先快后慢的双相释放过程。前6小时释放快速，而后速度变慢，5天内可持续释出药物。约25％、40％和62％的PTX可分别从MSCs-PTX，MSCs-NPs和MSCs-Micelles释放，5天释放总量为0.232pg/cell，0.379 pg/cell和0.792 pg/cell。相比于MSCs-PTX，MSCs-Micelles有利于提高药物释放量。 为考察MSCs-Micelles释放的药物是否能够被C6有效摄取，并产生抗肿瘤作用，我们进行了Transwell系统中C6细胞对PTX的摄取动力学及细胞毒性实验。MSCs-NPs和MSCs-Micelles组下室C6细胞内PTX量分别为0.03688±0.00034 pg/cell和0.04825±0.00042 pg/cell，胶束组是纳米粒组的1.3倍。MSCs-Micelles对C6有显著的抗肿瘤活性，其作用呈药物剂量和MSCs细胞数依赖关系。通过与8 ng/mL PTX-HA-PTX胶束孵育构建MSCs-Micelles，MSCs-Micelles与肿瘤细胞比例为1∶5时，C6细胞存活率为50％。在3D肿瘤球模型上，我们分别对MSCs和所负载药物的肿瘤球渗透能力和肿瘤球活力进行测定。结果显示，在肿瘤球边缘和内部均能够看到MSCs，说明载药MSCs不仅能够向肿瘤迁移，并且还能够向肿瘤内部渗透。经HA修饰后，MSCs-Micelles表现出更深的渗透。采用台盼蓝染色法对3D瘤体活力进行评价，结果表明MSCs-Micelles可诱导肿瘤球细胞凋亡，效果呈剂量和MSCs数量依赖。 最后，我们在大鼠原位脑胶质瘤模型上通过脑半球对侧给药方式研究了MSCs-Micelles体内靶向效果和抗胶质瘤活性。制备了载有Oregon Green(@)488荧光PTX(PTX-Flu)的载药胶束，并将其嵌载于MSCs，并对MSCs进行CM-Dil标记，观察MSCs-Micelles的脑内分布情况。MSCs注射2天后，可在肿瘤区域发现大量、散在分布的MSCs。而在注射部位只有少量MSCs成簇分布，证明了MSCs-Micelles体内对C6脑胶质瘤的归巢能力。同时，在肿瘤部位可观察到大量的药物绿色荧光，通过共定位实验发现，大部分PTX-Flu已被MSCs-Micelles释放。抗胶质瘤实验中，脑半球对侧单次注射(1μg/kg PTX)后，MSC-Micelles组的大鼠在意识或运动反应方面没有明显的异常，生存期显著高于其他实验组。Saline组、MSCs组、PTX-HA-PLGA组、MSCs-PTX组、MSC-NPs组和MSC-Micelles治疗组中位生存时间分别是14.5天、13.5天、22.5天、23.5天、38.5天和60天。对脑组织进行H&E染色后发现经Saline和MSCs空白组处理后均显示出大片肿瘤组织，肿瘤占位明显。PTX治疗组均表现出明显的肿瘤细胞坏死或凋亡。而在MSCs-Micelles组中胶质瘤区域的最显著减少，无明显肿瘤组织可见。 综上结果表明所构建的MSCs-Micelles生物靶向系统在体内可发挥显著的抗肿瘤作用。

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致谢

论文说明

摘要

缩写表

前言

1载药胶束的制备及表征

1．1．1仪器

1．1．2材料

1．2实验方法

1．2．2 HA-b-PLGA嵌段共聚物的表征

1．2．4载药胶束的表征

1．3结果与讨论

1．3．1 HA-b-PLGA嵌段共聚物的表征

1．3．2载药胶束的优化

1．3．3载药胶束的表征

1．4小结

2 MSCs-Micelles的构建

2．1．2材料

2．2．2载药胶束的细胞毒性

2．2．3 MSCs细胞摄取实验

2．2．4载药胶束对MSCs迁移能力的影响

2．2．5载药胶束对MSCs细胞周期的影响

2．3．1载药胶束的细胞毒性

2．3．2 MSCs细胞表面CD44受体表征

2．3．3 MSCs细胞摄取

2．3．4载药胶束对MSCs生物活性的影响

2．3．5 MSCs释放动力学研究

3 MSCs-Micelles的药物传递及药效评价

3．1．2材料

3．2实验方法

3．2．1 C6细胞摄取实验

3．2．2 MSCs-Micelles体外抗肿瘤活性评价

3．2．3 3D瘤体渗透及活力测定

3．3结果与讨论

3．3．1肿瘤细胞摄取及药效评价

3．3．2 3D瘤体渗透及活力测定

3．4小结

4体内研究

4．1仪器和材料

4．1．1仪器

4．1．2材料

4．2实验方法

4．2．2 MSCs-Micelles体内抗肿瘤实验

4．3．1 MSCs-Micelles的脑内分布

4．3．2 MSCs-Micelles体内抗肿瘤实验

4．4小结

参考文献

综述 基于间充质干细胞的小分子药物肿瘤靶向递送系统研究进展

作者简历