声明
致谢
摘要
1．1引言
1．2萜类化合物生物合成途径的研究进展
1．3合成生物学在高价值萜类化合物生产中应用
1．3．2紫杉醇
1．3．3类胡萝卜素
1．4檀香醇生物合成研究
1．4．1檀香烯与檀香醇简介
1．4．2檀香醇生物合成途径
1．4．3檀香醇生物合成调控策略及研究进展
1．5 CRISPR／Cas9基因编辑系统’
1．5．1 CRISPR／Cas9系统应用与发展
1．6本工作研究的基本思路及拟研究内容
2．1菌株与质粒
2．2仪器与试剂
2．2．1主要仪器
2．2．2工具酶及主要试剂
2．3培养基和培养条件
2．3．1酵母培养基
2．3．2酵母培养条件
2．3．3大肠杆菌培养基及培养条件
2．4实验方法
2．4．1大肠杆菌热激感受态的制备
2．4．2大肠杆菌热激感受态的转化
2．4．3质粒提取
2．4．4 PCR产物纯化与DNA腋回收
2．6酿酒酵母的转化
2．7酿酒酵母菌落PCR方法
2．8用CRISPR-Cas9系统在酿酒酵母染色体组插入或敲除基因
2．8．1 DNA片段的制备与sgRNA设计
2．8．2酿酒酵母利用CRISPR／Cas9进行基因编辑方法
2．9发酵条件
2．10发酵产物检测
第三章利用CRISPR／Cas9技术在酿酒酵母中整合MVA途径的研究
3．1引言
3．2材料和方法
3．2．1实验菌株及质粒
3．2．2培养基及培养条件
3．2．3大肠杆菌质粒提取及转化
3．2．4酵母电击转化感受态的制备以及转化方法
3．2．5酵母转化子验证
3．2．6 gRNA质粒pKan100的构建
3．2．7供体DNA片段制备
3．3结果与讨论
3．3．1考察不同长度目的基因的敲除效率
3．3．2利用40bp短同源臂进行片段整合
3．3．4利用CPRISPR／Cas9实现长途径的整合
3．4本章小结
第四章酿酒酵母生物合成檀香烯的代谢工程研究
4．1引言
4．2材料与方法
4．2．1菌种与质粒
4．2．2酵母内源IVIVA途径改造
4．2．4檀香烯表达载体杓楚
4．2．4不同强度启动子表达戴体构建
4．2．5低拷贝表达载体构楚
4．2．6胞内角鳖烯检测
4．3实验结果与讨论
4．3．1 triM1和ERG20过表达质粒的构楚
4．3．2内源MVA途径的上调
4．3．3不同强度 启动子对α-檀香烯产量的影响
4．3．4不同类型表达载体对于檀香烯产量的影响
4．4本章小结
第五章降低前体FPP合成角鲨烯的旁路代谢流对檀香烯生物合成的影响
5．1引言
5．2材料与方法
5．2．1菌株与质粒
5．2．2表达载体与菌株构楚
5．2．4菌株发酵
5．2．5发酵产物检测
5．3结果与讨论
5．3．1双表达质粒p426-SH构建
5．3．2 ERG9启动子替换
5．4本章小结
第六章不同信号肽对MVA途径靶向线粒体及提高檀香烯产率的研究
6．1引言
6．2材料与方法
6．2．1菌株
6．2．2基因克隆
6．2．3荧光信号检测方法
6．2．4线粒体定位效果检测方法
6．2．5发酵条件及产物检测
6．3结果与讨论
6．3．1比较不同信号肽靶向线粒体的效率
6．3．2靶向线粒体的檀香烯生物合成途径的构建
6．4本章小结
7．1结论
7．2展望
参考文献
攻读硕士期间的科研成果
