利用代谢工程改造大肠杆菌及酿酒酵母进行异戊二烯生物合成的基础研究

摘要

异戊二烯是自然界分布最为广泛、种类最为多样化的大类生物有机化合物-类异戊二烯的合成单体，同时作为合成化学工业的基础原料，被广泛应用于合成橡胶、医药、香料和农药等领域。目前工业上异戊二烯的供应主要依赖于石油基原料，其绿色清洁生产仍然是当前可持续发展战略中的一大挑战。大肠杆菌和酿酒酵母遗传背景清楚、操作简便，是工业生产中的理想模式微生物。因此，本研究采用大肠杆菌和酿酒酵母作为宿主菌，对微生物中异戊二烯的生物合成进行研究。
　　在利用大肠杆菌生物合成异戊二烯的研究中，首先，通过引入外源的异戊二烯合酶在大肠杆菌中构建一条异戊二烯生物合成途径，并通过单个基因的过表达，确定了MEP途径中的关键酶（DXS,DXR和IDI），其影响力顺序为IDI＞DXS＞DXR;其次，结合不同相容质粒共存体系及多顺反子方法，构建了载体形式的多基因共表达体系，实现了ISPS、DXS、DXR、IDI多个限速酶的共表达，并就多基因协同作用对代谢产物的影响进行了探索;然后，采用基因顺序调控对MEP途径进行了平衡调控，结果发现基因的表达顺序对异戊二烯的终产量具有重要影响，当基因表达顺序与代谢途径顺序一致时，代谢产物积累量最高;最后，结合蛋白质工程和代谢工程，提出了关键酶的共定向进化策略，异戊二烯的生产率提高了60％，达到4.18 mg·g-1·h-1(细胞干重，DCW,Dry Cell Weight)。
　　在利用酿酒酵母作为工程菌株生产高附加值生物化学品时，多基因途径的快速、稳定组装是生物合成中的一大瓶颈。为此，我们首先建立了一套即插即用、选择标记可循环使用的整合工具盒pUMRI。为了证实其有效性，将其应用于构建4个基因的β-胡萝卜素合成途径(～10kb DNA)，8个基因的MVA途径(～17kb DNA)和11个基因的番茄红素生物合成途径(～22kb DNA)。结合GAL调控系统，最终获得了两株类异戊二烯高产菌株，其中Y-carotene-01菌株的胡萝卜素含量达到16.3mg/g(DCW)，BY4742-C-04菌株的角鲨烯含量达到39mg/g(DCW)。
　　作为MVA途径的前体物质，乙酰辅酶A的充足供应对于类异戊二烯的积累是非常重要的，为此我们就细胞质和线粒体两个亚细胞结构进行了代谢工程调控。在细胞质的调控中，我们针对MVA途径、乙酰辅酶A合成途径及异戊二烯合成支路三个代谢模块，提出了推-拉-敲的组合调控策略，确定并解除了各个模块中的限速节点。综合调控后异戊二烯的产量达到18.5mg/L，提高了394倍。在线粒体的调控中，首先，以GFP作为报告基因进行了荧光定位表征，建立了线粒体的基因定位策略。然后，将线粒体定位序列引入pURMI工具盒，在线粒体内构建了一条MVA途径。为了提高异戊二烯的产量并缓解MVA途径在线粒体内构建后造成的中间代谢积累对细胞生长造成的毒性，采用了GAL调控和好氧调控策略，异戊二烯的产量达到133mg/L，该结果证实了线粒体调控的有效性。最后，将线粒体和细胞质两个亚细胞结构域进行了协同调控，最终异戊二烯的产量达到158mg/L。
　　本文以多基因表达方法及整合工具的建立为基础，结合蛋白质工程及多种代谢调控策略，有效地提高了微生物中的异戊二烯的生物合成效率，为其工业化生产提供了技术支持。

目录

声明

致谢

摘要

缩写简表

第一章 文献综述

1．1 异戊二烯简介

1．2 异戊二烯的应用

1．2．1 异戊二烯在聚合物领域的应用

1．2．2 异戊二烯在精细化工领域的应用

1．3 异戊二烯的工业生产工艺

1．3．1 C5馏分分离生产异戊二烯

1．3．2 脱氢法生产异戊二烯工艺

1．3．3 化学合成异戊二烯工艺

1．3．4 生物合成法

1．4 合成代谢途径概述及进展

1．4．1 合成代谢途径的发展及定义

1．4．2 合成代谢途径的基础生物组件及工具

1．4．3 合成代谢工程的策略及创新性实例

1．5 类异戊二烯的生物合成

1．5．1 类异戊二烯

1．5．2 类异戊二烯的生物合成途径

1．5．3 经典的药物类异戊二烯生物合成实例

1．5．4 异戊二烯的生物合成研究进展

1．6 本课题的研究内容及意义

第二章 大肠杆菌中调控MEP途径提高异戊二烯的产量

2．1 前言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 菌株及质粒

2．2．2 生化试剂及药品

2．2．3 试剂及培养基配方

2．2．4 仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 分子克隆的常规生物学操作

2．3．2 Isps，Dxs，Dxr，Idi多基因重组质粒的构建

2．3．3 Dxs／Dxr／Idi的共定向进化

2．3．4 大肠杆菌的培养及细胞生长的标定

2．3．5 蛋白电泳及Gel-Pro Analyzer软件分析

2．3．6 不相容质粒的共存验证

2．3．7 异戊二烯的定性分析及定量检测

2．3．8 番茄红素的提取与分析检测

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 异戊二烯合成途径的构建

2．4．2 pET-32a和pET-30a不相容质粒体系的稳定性验证

2．4．3 MEP途径中关链酶的确定

2．4．4 关键酶的串联表达及顺序调控

2．4．5 串联Dxs／Dxr／Idi的共定向进化

2．5 本章小结

第三章 酿酒酵母中整合工具的构建

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 菌株及质粒

3．2．2 实验仪器及生化材料

3．3 实验方法

3．3．1 分子生物学操作

3．3．2 pUMRI工具金的构建

3．3．3 pUMRI工具盒的使用方法

3．3．4 pUMRI工具盒的marker去除表征

3．3．5 多基因β-胡萝卜素合成途径途径的组装及基因型验证

3．3．6 多基因甲羟戊酸途径(MVA)的组装

3．3．7 多基因番茄红素合成途径的组装

3．3．8 组装途径的功能分析

3．3．9 重组菌的生长曲线制作

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 pUMRI工具的构建及循环使用策略

3．4．2 整合工具选择标记去除表征

3．4．3 pUMRI工具盒在较长途径整合中的应用

3．5 本章小结

第四章 酿酒酵母细胞质中的代谢调控

4．1 前言

4．2 实验仪器及材料

4．3 实验方法

4．3．1 乙酸检测及标曲制作

4．3．2 乙醇检测及标曲制作

4．3．3 载体及菌株的构建

4．3．4 启动子比较方法

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 异戊二烯生物合成途径的构建

4．4．2 MVA途径的代谢调控

4．4．3 乙酰辅酶A途径的代谢调控

4．4．4 异戊二烯合成支路的代谢调控

4．5 本章小结

第五章 酿酒酵母中不同亚细胞域乙酰辅酶A的综合利用

5．1 前言

5．2 实验仪器、材料、培养基及引物

5．3 实验方法

5．3．1 基因在线粒体中的定位方法及鉴定

5．3．2 MVA途径组装及调控中的质粒构建

5．3．3 细胞质和线粒体双调控策略及菌株构建

5．3．4 基因型验证

5．3．5 发酵条件

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 线粒体中MVA途径的构建

5．4．2 线粒体中MVA途径的整合对细胞生长及异戊二烯产量的影响

5．4．3 碳源、好氧调控提高细胞生长量及异戊二烯的产量

5．4．4 MVA途径在细胞质和线粒体内的双调控

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

作者简历及攻读博士学位期间的研究成果