间充质干细胞向食道组织细胞的诱导分化及其在食道组织再生中的应用

摘要

目的：
　　探讨间充质干细胞（MSC）向食道平滑肌细胞、上皮细胞诱导分化的有效方法和机制，为食道组织工程提供种子细胞；探索电纺丝纤维、脱细胞食道粘膜与生物可降解聚氨酯（PU）复合支架的构建以及动物体内重建修复食道缺损的可行性方法。
　　方法：
　　以密度梯度法提取和培养MSC，流式细胞术检测CD29、CD34、CD45、CD44、CD90的表达情况。分别采用与成熟平滑肌细胞共培养，EGF等诱导剂直接诱导的方法，诱导MSC向平滑肌细胞和上皮细胞分化，通过形态观察、免疫荧光染色等方法检测上述诱导方法的有效性。另一方面，以静电纺丝法制备PCL/SF（聚己内酯/丝素）多孔纳米纤维（模拟食道基膜niche），表面活性剂联合DNA酶法制备脱细胞食道粘膜基质，以生物可降解PU为基材制备具有微槽图案的支架（支持肌组织生长），以正常食道的组织学构造为导向，复合上述多层支架构造，制备了可同时支持食道组织中粘膜、粘膜下层和肌层细胞和组织再生的复合支架。以MSC为种子细胞，新西兰大白兔为实验动物，首先行背部皮下埋植以检测支架的组织相容性及支架在体内的作用，包括炎症、周围组织供血、支架降解等；其次，建立小型动物缺损模型，以片状支架植入颈段食道，以检测支架与体内食道的作用以及修复小范围食道缺损的可行性；最后，在上述实验成功的基础上，构建管状食道支架，建立原位替代整环食道使其再生的技术，包括粘膜和肌层的再生。
　　结果：
　　培养的MSC细胞梭形，呈旋涡状排列，强表达间充质干细胞的特征蛋白CD29、CD44、CD90；不表达CD34、CD45。诱导分化的MSC分别表达平滑肌细胞、上皮细胞的特异蛋
　　白α-actin和CK14。动物皮下实验结果显示支架具有良好的生物学性能；原位替代实验中，所有兔子未出现吻合口瘘，染色结果显示手术部位实现上皮化，并可见平滑肌再生。
　　结论：
　　MSC采用上述方法可以完成平滑肌细胞、上皮细胞的诱导分化。由电纺丝纤维、脱细胞食道粘膜与有槽化聚氨酯（PU）复合构建的支架，能支持MSC的生长，植入动物体内未出现免疫排斥，可原位支持食道粘膜和肌层的再生，这些技术有望实现对病变食道缺损的修复。

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引言

1材料与仪器设备

1.1实验材料

1.2实验仪器

2种子细胞获取与支架制备

2.1细胞原代培养与诱导分化

2.2支架构建

3 MSC细胞相容性与组织相容性研究

3.1 MTT检测细胞的生长增殖

3.2皮下实验

3.3食道原位替代实验

4结果

4.1 MSC的培养及鉴定

4.2 MSC向平滑肌细胞诱导分化

4.3 MSC向上皮细胞诱导分化

4.4支架的细胞相容性

4.5支架的组织相容性-动物实验

5讨论

6结论

参考文献

附录A 主要试剂配制

附录B中英文词对照

在学研究成果

致谢