骨髓间充质干细胞的诱导分化及兔食道原位修复的研究

摘要

目的：
　　对提取培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)进行体外诱导分化，研究它的分化方法还有它的分化机制；以兔为实验动物，以MSCs为种子细胞，结合可降解聚氨酯(PU)和脱细胞食道粘膜构建复合支架，建立兔食道缺损原位修复模型，探究食道原位修复重建的可行性。
　　方法：
　　骨髓间充质干细胞通过密度梯度离心法进行提取培养获得，对培养的3代细胞分别采用共培养即与平滑肌细胞共同培育和在培养基中添加EGF等诱导因子的方法来诱导MSCs向平滑肌细胞和上皮细胞在体外进行定向的分化，采用荧光免疫染色来确定该方法的体外诱导可行性。以羟基荧光素二醋酸盐琥珀亚酰胺酯(CFSE)对MSCs进行荧光标记，通过MTT法检测荧光染料对标记后细胞生长和增殖的影响。同时，脱细胞食道粘膜基质通过DNA酶联合表面活性剂制备，通过1,4-二氧六环溶液溶解生物可降解的聚氨酯(PU)获得PU溶液，倒在自制的带微槽构造的硅材质模具，制备点断微槽图案（槽宽100μm，槽深30μm，间隔30μm，间隔前后间距30μm，间隔长150μm）和连续微槽图案（槽宽200μm，槽深30μm，间隔30μm）的支架（支持肌细胞生长）。为改善PU支架的亲水性能和生物相容性，采用胺解法对PU支架表面接枝丝素蛋白(SF)。以MSCs为种子细胞结合PU支架及脱细胞粘膜构建复合支架，采用实验用新西兰大白兔建立动物缺损重建修复模型。将种植了干细胞的复合支架植入兔食道，通过组织切片的荧光检测来探索干细胞在兔食道微环境中的定向分化的趋向，同时检测复合细胞支架在体内的作用以及食道损伤修复的可行性。
　　结果：
　　荧光检测发现诱导分化的MSCs有平滑肌细胞的特异蛋白α-actin和上皮细胞特异蛋白CK14荧光表达。通过MTT检测可见荧光标记细胞的生长、增殖与正常的细胞无明显差异。在兔食道原位修复实验中，实验兔在护理期后均正常进食，切片染色结果显示手术部位食道修复完全组织结构完整。荧光显微镜下，可见标记细胞的绿色荧光存在，同时免疫荧光检测到平滑肌细胞特异性蛋白的荧光表达。
　　结论：
　　采用共培养和添加诱导剂的方法可以诱导 MSCs定向分化为平滑肌细胞和上皮细胞。MSCs种子细胞结合脱细胞食道粘膜和PU制备的复合支架，植入动物体内无免疫排斥现象出现，可实现缺损食道粘膜和肌层的修复再生，有望成为一种新的食道修复、再生替代物。

目录

声明

引言

1材料与仪器设备

1.1实验材料

1.2实验仪器

2实验方法

2.1 原代细胞的提取培养与诱导分化

2.2 支架材料的制备

3 细胞相容性检测及动物体内实验

3.1 MSCs细胞荧光标记

3.2 MTT法检测细胞的生长

3.3动物体的支架原位修复

4结果

4.1 MSCs的培养及流式检测

4.2 免疫荧光检测MSCs的诱导分化

4.3 CFSE标记浓度优化

4.4支架的细胞相容性检测

4.5动物实验结果

5讨论

6结论

参考文献

附录A主要试剂配置

附录B中英文对照

在学研究成果

致谢