大肠癌组织中EDNRB启动子甲基化状态检测

摘要

目的：大肠癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一。EDNRB是一个新发现的潜在的肿瘤抑制基因，它曾被报道在多种肿瘤中通过启动子甲基化引起基因表达沉默。然而，EDNRB基因在大肠癌的功能尚不清楚。在本研究中，我们研究了 EDNRB在大肠癌组织及对照组织中的DNA甲基化状态、mRNA表达水平，及其与临床数据的关联。
　　方法：1、大肠癌组织样本收集：本研究收集了2012年6月至2013年4月之间在某医院胃肠外科、肛肠外科及肿瘤外科接受手术治疗的大肠癌患者的癌组织及正常组织各42例。切取标本时，正常组织标本距离肿瘤至少5cm。组织被切下后立即放入液氮中冻存，之后转移到-80℃冰箱保存。2、MSP：使用离心柱法提取42对大肠癌组织和正常对照组织的DNA，检测 DNA的浓度和质量，采用亚硫酸氢盐修饰法进行甲基化转化，修饰后的DNA用于 PCR扩增模板。最后，将 PCR产物进行凝胶电泳。3、qRT-PCR：使用TRIzol试剂提取42对大肠癌组织和正常对照组织的RNA，检测 RNA的浓度和质量，进行逆转录，合成的cDNA根据两步法行 qRT-PCR扩增，记录下仪器中的扩增曲线、溶解曲线、Ct值，并且将 qRT-PCR产物行凝胶电泳，以鉴定产物的特异性。4、统计学分析：EDNRB启动子甲基化的比较采用卡方检验的校正公式。2–ΔCt法用于分析qRT-PCR的结果。采用配对 t检验进行两组相关数据间比较。两组独立样本不符合正态性检验，则采用Mann-Whiteney U检验比较。认为p<0.05有统计学显著差异。
　　结果：通过 MSP检测，42例大肠癌组织的EDNRB基因启动子甲基化率（阳性率为92.86％）明显高于42例正常对照组织 EDNRB基因启动子甲基化率（阳性率为59.52%）。大肠癌组织 EDNRB甲基化率与大肠正常组织甲基化率相比，差异有显著意义（p=0.001）。另外我们研究了 EDNRB基因甲基化状态和大肠癌患者的临床特征之间的关联，结果显示它们之间均没有显著关联。
　　通过qRT-PCR检测，42例大肠癌组织的EDNRB mRNA表达水平（0.31±0.91）明显低于42例正常对照组织 EDNRB mRNA表达水平（0.70±1.18）。大肠癌组织 EDNRB mRNA表达水平与大肠正常组织 EDNRB mRNA表达水平相比，差异有显著意义（p=0.032）。另外我们研究了 EDNRB基因 mRNA表达水平和大肠癌患者的临床特征之间的关联，结果显示它们之间均没有显著关联。
　　结论：
　　本研究工作以大肠癌组织、正常对照组织为研究对象，研究大肠癌组织中EDNRB基因启动子甲基化状态及 mRNA表达水平，得出以下结论：
　　1、大肠癌组织中 EDNRB基因启动子甲基化率较高，而正常对照组织 EDNRB基因启动子甲基化率较低。
　　2、大肠癌组织中 EDNRB基因启动子甲基化水平与大肠癌患者的临床特征之间无明显相关性。
　　3、大肠癌组织中 EDNRB mRNA表达水平较低，而正常对照组织 EDNRB mRNA表达水平较高。
　　4、大肠癌组织中 EDNRB mRNA表达水平与大肠癌患者的临床特征之间无明显相关性。
　　说明EDNRB mRNA表达异常可能与大肠癌的发生有关，而 EDNRB基因启动子甲基化可能引起 EDNRB的表达沉默。提示 EDNRB基因启动子甲基化可以作为大肠癌早期诊断的标志物，也可当做大肠癌生物治疗的新靶点。

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引言

1实验目的

2研究对象及临床资料的收集

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1大肠癌组织，正常对照组织

3.1.2主要实验仪器

3.1.3主要实验试剂

3.2实验方法

3.2.1收集的组织（大肠癌组织、正常对照组织）行甲基化特异性PCR （MSP）

3.2.2收集的组织（大肠癌组织、正常对照组织）行qRT-PCR

3.3统计分析

4实验结果

4.1大肠癌EDNRB启动子甲基化检测（MSP）

4.2 EDNRB甲基化与临床特征的相关性

4.3 EDNRB在大肠癌组织中表达下调

4.4 EDNRB表达水平与临床特征的相关性

5讨论

6结论

参考文献

附录A 中英文对照表

附录B 文献综述

在 学 研 究 成 果

致谢