药物成瘾候选基因的DNA甲基化研究

摘要

目的：本研究测定病例对照中药物成瘾易感基因的DNA甲基化水平，探究DNA甲基化水平与药物成瘾的关系。并验证所检测区域的DNA甲基化是否会引起表达量的改变。
　　方法：收集确诊的药物成瘾患者60例和健康对照52例，利用焦磷酸测序法对BDNF、DRD4和OPRK1基因的启动子区域 CGI进行 D N A甲基化水平测定。并与患者的POMS问卷结果进行关联性分析。借助双荧光素酶报告系统检测DNA甲基化水平测定区域对表达的影响，通过5’AZA去甲基化处理，检测测定区域的DNA甲基化改变对表达的影响。
　　结果：(1)海洛因成瘾对精神情绪状态上的影响比甲基苯丙胺更大。尤其是愤怒-敌意评分(P=0.010)，抑郁-沮丧评分(P=0.033)，有力-好动评分(P=0.001)和困惑-迷茫评分(P=0.001)；(2)病例对照研究：药物成瘾组 BDNF CpG1-CpG4高甲基化，而CpG5低甲基化(P=0.002)；DRD4启动子 CpG1(P=0.009)、CpG4(P=0.009)和CpG7(P=0.003)高甲基化，OPRK1启动子 C p G2-C p G7呈现低甲基化(P<0.05)；(3)甲基苯丙胺组 BDNF CpG3甲基化水平高于海洛因组(P=0.024)，而其他位点均没有显著差异(P>0.05)；(4) BDNF CpG5的甲基化水平都分别与抑郁-沮丧评分(P=0.018)，疲惫-惰性评分(P=0.016)，愤怒-敌意评分(P=0.036)和紧张-焦虑评分(P=0.010)呈负相关，而 DRD4 CpG6的甲基化水平与药物成瘾患者的迫切性评分有负相关性(P=0.017)。亚组分析发现，海洛因组中 B D N F C p G5甲基化水平与疲惫-惰性评分负相关(P=0.032)；DRD4 CpG5甲基化水平与抑郁-沮丧评分正相关(P=0.002)，OPRK1 CpG2甲基化水平与疲惫-惰性平分负相关(P=0.020)；(5) BDNF检测区域片段缺失会引起表达下调(P=0.019)，OPRK1检测区域片段缺失会引起表达上调(P=0.013)，而DRD4检测区域片段缺失，基因表达严重受阻(P=0.000002)；(6) BDNF检测区域片段去甲基化后引起表达下调(P=0.008)，OPRK1检测区域片段去甲基化后表达上调(P=0.044)。
　　结论：病例对照研究：BDNF CpG5低甲基化；DRD4启动子 CpG1、CpG4和CpG7高甲基化，OPRK1启动子CpG2-CpG7呈现低甲基化与药物成瘾患病风险有关。而 BDNF CpG3甲基化水平可用于评价海洛因成瘾与甲基苯丙胺成瘾之间的差异；
　　在四类情绪状态评分上(愤怒-敌意评分，抑郁-沮丧评分，有力-好动评分和困惑-迷茫评分)，海洛因组的影响都比甲基苯丙胺更大；BDNF，DRD4和OPRK1三个基因的甲基化水平与不同的情绪状态有关。
　　所测定的区域都与基因表达量有关联，BDNF检测区域片段缺失会引起表达下调，OPRK1检测区域片段缺失会引起表达上调，而 DRD4检测区域片段缺失，基因表达严重受阻；BDNF测定区域去甲基化后引起表达下调，OPRK1检测区域片段去甲基化后表达上调。

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引言

1目的

2实验材料与方法

2.1实验仪器

2.2主要试剂

2.2.1部分试剂配制

2.3人群样本的甲基化水平测定

2.3.1候选基因的挑选

2.3.2引物设计

2.3.3实验对象

2.3.4外周血全基因组DNA 的提取

2.3.5亚硫酸氢盐处理

2.3.6 PCR 反应

2.3.7焦磷酸测序

2.4重组质粒的构建

2.4.1引物设计

2.4.2目标片段的PCR扩增

2.4.3 pGL3质粒提取

2.4.4 PCR片段和pGL3粘性末端的获得

2.4.5 PCR片段和pGL3连接

2.4.6转化产物的鉴定

2.5 293细胞培养和重组质粒转染

2.5.1 293细胞复苏

2.5.2细胞传代

2.5.3细胞冻存

2.5.4提取去内毒素的重组质粒

2.5.5细胞种板和脂质体转染：

2.5.6脂质体转染：

2.5.7双荧光素酶报告系统检测

2.5.8 5’AZA处理

2.6数据统计分析

3结果

3.1临床资料比较和各基因检测的CpG 位点信息

3.2药物成瘾组与健康对照组甲基化水平比较

3.3海洛因组和甲基苯丙胺组甲基化水平比较和POMS评分关联性分析

3.4重组质粒的构建

3.5检测目的片段对基因表达的影响

3.6 5’AZA对检测目的片段基因表达的影响

4讨论

参考文献

附录A 部分中英文对照表

附录B 综述

在学研究成果

致谢