研究阿尔茨海默病多个候选基因的DNA甲基化机制及功能研究

摘要

目的：本研究主要通过检测病例对照组外周血中阿尔茨海默病（AD）易感基因的DNA甲基化水平差异，以及所检测区域对基因表达功能的影响，从而探究 DNA甲基化水平的改变和 AD之间的关系。
　　方法：收集血液样本共108例，其中包含确诊 AD患者44例和正常对照62例，通过焦磷酸测序的方法对 BDNF、DRD4、OPRD1、OPRM1、OPRK1、OPRL1、GPR50和 DISC1基因的启动子区域 CpG岛进行甲基化水平的检测；同时收集参与者的表型信息用于后期的相关性分析。通过双荧光素酶报告基因实验验证被测片段是否具有调节基因表达的功能。
　　结果：1） AD组中 BDNF甲基化率显著高于正常对照组（CpG1：p=0.021；CpG2：p=0.002；CpG3：p=0.007；CpG4：p=0.005；平均甲基化水平：p=0.004）。性别分层后，发现 CpG2位点甲基化率在男性 AD患者中显著高于男性对照组（p=0.018），CpG4甲基化率在女性患者中显著高于女性对照组（p=0.039）。另外，用药和 BDNF甲基化率之间无显著相关性（p>0.05）。2）在总样本和男性样本中，AD患者的甲基化水平显著高出正常对照（总体：p=4.69E-5，男性：p=9.17E-05，女性：p=0.080）。服用艾斯能药物的患者相较安理申使用者 CpG3位点甲基化率高（p=0.044）。在男性中发现，DRD4甲基化率和 ApoA及 CRP水平显著相关（ApoA：p=0.042； CRP：p=4.06E-5）。女性中发现，DRD4基因甲基化率和 ApoA，CRE及 CRP水平显著相关（ApoA：p=3.65E-05；CRE：p=0.045；CRP：p=0.041）.3）AD患者 OPRD1 CpG3位点的甲基化程度均显著高于正常对照（CpG1：p=0.052；CpG2：p=0.094； CpG3：p=1.68E-7）。我们的研究发现在女性对照组中CpG3位点甲基化率和 HDL-C呈正相关（p=0.033），在女性病例组中和磷离子浓度呈正相关（p=0.020）。另外，该位点甲基化率和 ALP水平在所有对照中显著负相关（p=0.009）。在 AD组中，磷离子和 CpG3位点甲基化率在总样本中呈正相关（p=0.001）。年龄也是 AD非常重要的一个影响因素，我们研究发现 OPRD1 CpG1甲基化水平和年龄在女性 AD患者中呈正相关性（r=0.434，p=0.034）。后期的细胞实验发现插入的OPRD1启动子区域片段具有增强下游基因表达的功能（fold=2.2，p=0.01）。4）与正常对照相比，OPRM1甲基化程度在总样本和男性 AD患者中显著增高（总体：p=0.11；男性：p=0.039）。此外，年龄和 OPRM1甲基化程度在正常对照和女性对照组中均呈正相关（总体对照：r=0.326，p=0.009；女性对照：r=0.641，p=0.006）。后期的荧光素酶报告基因实验显示插入片段具有增强下游基因表达的功能（p=0.003）。5） OPRK1甲基化水平在 AD组中显著高于对照组（CpG1：p=3.22E-04；CpG2：p=0.006；CpG3：p=0.029；平均甲基化水平：p=0.006）。年龄和甲基化水平呈正相关（p=0.041）。进一步的分组分析发现，年龄和该基因甲基化水平在 AD组中没有显著相关性，但是在对照组中呈正相关（病例组：p=0.999；对照组：p=0.003）。在女性人群中，该基因和TBIL、DBIL、IBIL和 ALT均呈负相关（TBIL：p=0.012； DBIL：p=0.011； IBIL：p=0.025； ALT：p=0.026）。将 OPRK1目的片段插入 pGL3-basic载体，发现该片段具有上调下游基因表达的功能（fold=2.248，p=0.0235）。6） OPRL1基因的四个 CpG位点在 AD患者中都显著性增高（CpG1：p=4.43E-05，CpG2：p=8.56E-05，CpG3：p=1.70E-06，CpG4：p=0.031）。7）男性 AD患者的GPR50甲基化程度显著低于正常男性（p=0.002）。该基因甲基化水平性别差异显著，无论是在 AD患者中还是正常人群中，在女性中的甲基化程度均显著高于男性（病例组：p=2.26E-09，对照组：p=1.10E-04）。同时，在男性中，脂蛋白 A及镁离子和甲基化程度具有显著的相关性（r=-0.322，p=0.031），而在女性中发现，钠离子和甲基化程度呈正相关（r=0.478，p=0.002）。另外镁离子浓度和甲基化水平在男性中呈负相关（r=-0.406，p=0.005）。8）DISC1甲基化程度在 AD患者中显著性增高，这种显著性增高在性别分层后依然存在（总体：p=1.65E-05；男性：p=0.001；女性：p=0.023）。
　　结论：BDNF、DRD4、OPRD1、OPRM1、OPRK1、OPRL1和 DISC1基因的启动子区域 CpG岛甲基化水平在 AD患者组中均显著高于对照组，GPR50基因启动子区域甲基化水平在 AD组中偏低。这些基因启动子区域的甲基化水平和AD的发生发展具有相关性。

目录

声明

引言

目的

1实验材料与方法

1.1实验仪器

1.2实验试剂

1.2.1 部分试剂配方

1.3 实验对象

1.4 外周血基因组DNA的提取

1.5 DNA甲基化水平测定

1.5.1 候选基因的挑选

1.5.2 引物设计

1.5.3 亚硫酸氢盐处理

1.5.4 PCR反应

1.5.5 焦磷酸测序

1.6 重组质粒的构建

1.6.1 引物设计

1.6.2 目标片段 PCR扩增

1.6.3 pGL3 Basic质粒提取

1.6.4 PCR片段和 pGL3粘性末端的获得

1.6.5 PCR片段和 pGL3 Basic载体连接

1.6.6 转化产物的鉴定

1.7 HEK293T细胞培养和重组质粒转染

1.7.4 提取重组质粒，pGL3 Basic质粒及 pRL-SV40质粒

1.7.5 细胞种板和转染

1.7.6 双荧光素酶报告系统检测

1.8数据统计分析

2结果

2.1 样本临床信息

2.2 AD易感基因甲基化结果分析

2.2.1 BDNF结果

2.2.2 DRD4结果

2.2.3 OPRD1结果

2.2.4 OPRM1结果

2.2.5 OPRK1结果

2.2.6 OPRL1结果

2.2.7 GPR50结果

2.2.8 DISC1结果

3讨论

参考文献

附录A 部分中英文对照表

附录B 综述:阿尔茨海默病相关基因的DNA甲基化研究进展

在学研究成果

致谢