温度胁迫对渔业野生种中国小孔蛸精巢HSP70的影响

摘要

中国小孔蛸（Cistopus chinensis），又名嘉庚蛸（Octopus tankahkeei），隶属软体动物门头足纲蛸科，为我国东南沿海潮间带生活的重要经济动物之一，其繁殖、发育与生长易受潮间带环境变化的影响。HSP70是热休克蛋白家族中重要的一员，当生物体受到环境变化胁迫时，细胞内 HSP70表达量增高，帮助变性蛋白恢复正常的构象，以发挥细胞保护的生物学功能。
　　为了解温度胁迫下中国小孔蛸精巢中 HSP70的可能作用，采用兼并 PCR和RACE等技术首次克隆得到该物种的HSP70基因，并进行了氨基酸序列分析、多重序列比对及进化树构建。采用 RT-PCR技术分析了HSP70 mRNA在精巢、肝胰腺、肾脏、唾液腺、鳃和肌肉6个组织中的表达情况。将中国小孔蛸置于32℃海水中热激2h，然后再置于13℃海水中暂养，并在不同的暂养时间（0–24h）取精巢组织，采用实时定量 PCR技术分析了不同暂养时间点精巢HSP70 mRNA的表达变化情况，采用透射电镜技术观察了高温刺激对精巢的超微结构损伤。此外，利用免疫组化技术检测了HSP70蛋白在精巢中的分布。研究结构及结论简要概括如下：
　　HSP70 cDNA全长为2471bp，包括89bp5’非编码区（5’-UTR），426bp3’-UTR及1956bp开放阅读框。编码651个氨基酸，分子量与等电点分别为71.8kDa和5.34。氨基酸序列分析及多重序列比对结果显示，HSP70属于细胞质HSP70家族，进化树显示该物种 HSP70和文蛤等其他软体动物 HSP70具有较近的亲缘关系。组织特异性表达分析表明，HSP70在精巢中表达量最高，肾脏和唾液腺次高，肝胰腺、鳃及肌肉中表达量相对较低。免疫组化实验结果显示，HSP70蛋白在精原细胞、精母细胞、精细胞及精子中均有表达。实时定量PCR结果显示，同对照组相比，中国小孔蛸在32℃海水中热激2h后，精巢HSP70 mRNA表达量出现短暂的下降；当转移到13℃海水中暂养2h后，该基因表达量升高并达到峰值；在暂养4h和6h后表达量逐渐下降，但仍高于对照组；在暂养8 h后达到最低；但当暂养到12h时再次升高并达到峰值。分析认为，HSP70在精子发生及精巢抵御温度胁迫中可能发挥重要的作用。

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引言

1 综述

1.1我国经济蛸类渔业生物学、人工繁殖及养殖技术研究概况

1.1.1 蛸类的分类及分布

1.1.2 蛸类的渔业生物学特性

1.1.3 蛸类的人工育苗及养殖技术

1.2软体动物HSP70研究概况

1.2.1 软体动物 HSP70的结构

1.2.2 软体动物HSP70蛋白在细胞中的分布

1 . 2 . 3 软体动物在环境胁迫下 HSP70的表达

1.2.4 软体动物 HSP70基因表达的调控

1.3 问题与展望

2 温度胁迫下中国小孔蛸精巢中HSP70的表达分析

2.1材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果

2.2.1 HSP70 cDNA及氨基酸序列

2.2.2多重序列比对结果及系统进化树

2.2.3 HSP70 mRNA在不同组织中的表达

2.2.4 高温胁迫下精巢组织的超微结构损伤

2.2.5 高温胁迫下精巢中HSP70 mRNA的表达

2.2.6 抗HSP70血清的特异性

2.2.7 HSP70蛋白在精巢中的分布

2.3 讨论

2.3.1 HSP70基因序列及组织表达特征

2.3.2 高温胁迫下组织的超微结构损伤

2.3.3 温度胁迫下HSP70 mRNA的表达特征

2.3.4 HSP70蛋白在精巢中的分布特征

3 小结

3.1 主要结果

3.2 创新点

3.3 研究展望

参考文献

在学期间的研究成果

在学期间参与的研究项目

致谢