马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp70的克隆及温度胁迫下的表达特性

摘要

[目的]热激蛋白(heat shock protein,HSP)是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用.当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动.本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,对其热激蛋白HSP70基因(Ld-hsp70)进行克隆,并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析,明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用.[方法]基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列,利用RT-PCR和RACE技术对Ld-hsp70的全长cDNA进行克隆;利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接;采用生物信息学方法对Ld-hsp70及其编码氨基酸的序列特性进行分析;使用MEGAX软件的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对Ld-hsp70在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析;利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物.[结果]基于NCBI数据库获得3类马铃薯甲虫HSP70cDNA序列,分别命名为HSP70a、HSP70b和HSP70c,经克隆、拼接获得其全长序列,分别命名为 Ld-hsp70a、Ld-hsp70b和 Ld-hsp70c,GenBank 登录号分别为 KC544268、KC544269和 KC544270.序列分析表明,3个Ld-hsp70编码的氨基酸序列均包含了完整保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序.Ld-hsp70a和Ld-hsp70c的氨基酸C末端具有保守基序EEVD,属于胞质型热激蛋白;Ld-hsp70b的氨基酸C末端具有保守基序KDEL,属于内质网型热激蛋白.系统进化树分析显示,Ld-hsp70a和Ld-hsp70b与其他物种的HSP70分别聚为一支,Ld-hsp70c与已报道的马铃薯甲虫HSP70聚为一支.其中,Ld-hsp70a与龟纹瓢虫(Propylaea japonica)的 Pj-hsp70,Ld-hsp70b 与稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)的Lo-hsp70,Ld-hsp70c与大猿叶甲(Colaphellus bowringi)的Cb-hsp70同源性最高.qRT-PCR结果表明,高、低温均能诱导马铃薯甲虫雌、雄成虫的3个Ld-hsp70的表达.不同温度胁迫处理1 h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫体内3个Ld-hsp70的相对表达量未见显著变化;而4h后,马铃薯甲虫雌、雄成虫Ld-hsp70a的相对表达量与对照相比分别在低温-10°C和高温44°C时显著上调至2.24和2.41倍,Ld-hsp70b和Ld-hsp70c相对表达量在胁迫4h后与对照相比差异均不显著.另外,无论是雌虫还是雄虫,3个Ld-hsp70的相对表达量在同一温度不同的胁迫处理时间之间均无显著差异.[结论]Ld-hsp70a可以响应高、低温胁迫,可能在马铃薯甲虫抵御温度胁迫中发挥作用,而Ld-hsp70b和Ld-hsp70c对高、低温均不敏感,表明马铃薯甲虫3个Ld-hsp70在抗温度胁迫中发挥不同的作用.