人骨髓间充质干细胞对人精原干细胞体外增殖的影响

摘要

目的：探讨人骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)体外分离及纯化的方法；人精原干细胞(Spermatogonialstem cells，SSCs)在人骨髓间充质干细胞饲养层上的生物学特征及增殖的可能机制。 方法： ①人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定：流产4h胎儿取双侧股骨，去除贴附在骨表面的肌肉组织，剪断两端骨垢，用DMEM培养基冲洗骨髓腔细胞入离心管，吹打后离心8min(速度1000r/s)，去上清，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，调整细胞浓度为6×105/mL接种，将细胞置于37℃恒温、5％CO2的孵箱内培养4h后，换液去除未贴壁细胞，以后每3d换液。当细胞铺满培养瓶底70％-80％时传代，传代前24h细胞换液；吸出废液，PBS冲洗，加含有EDTA的胰酶消化2min，Hank's终止消化，吹打，离心，按1：2的比例传代，将细胞置37℃孵箱培养，4h换液，进一步纯化BMSC，以后每3d换液。倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特征，应用MTT法间接测定各代骨髓间充质干细胞活性。检测骨髓间充质干细胞表面标志物CD44。 ②人支持细胞培养及鉴定：无菌条件下剪开睾丸囊取出睾丸置培养皿中，去白膜后移至试管内尽可能剪碎，加入十倍体积的1mg/mL胶原酶Ⅳ，在37℃、5％CO2条件下作用20min，静止后去上清，加0.25％胰酶消化4min，加含血清DMEM终止消化，吹打，静止后取上清，离心8min(速度1000r/s)，去上清液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基调节细胞密度至3×105个/mL接种在培养瓶内，将细胞置于37℃恒温、5％CO2的孵箱内培养4h，换液去除未贴壁细胞。当细胞铺满培养瓶底70％-80％时传代，传代前24h细胞换液。吸除废液，PBS冲洗，加含有EDTA的胰酶消化2min，加Hank's终止消化，吹打使细胞重悬，离心，按1：2的比例传代，将细胞置37℃孵箱培养，以后每3d换液。鉴定：支持细胞的油红0染色，用以鉴定支持细胞。 ③饲养层的制备：当培养的人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底70％-80％时，用含10 ug/mL丝裂霉素C的DMEM培养基处理同代的两组骨髓间充质细胞各1.5h，PBS液清洗后随机取一组作为饲养层备用，另一组作为对照组(CG)。当培养的人支持细胞铺满培养瓶底70％-80％时，用丝裂霉素C处理，方法同上，作为饲养层备用。 ④精原干细胞的纯化及鉴定：取材方法同培养支持细胞。将睾丸细胞悬液置于37℃恒温、5％CO2的孵箱内培养，4h后吸取培养液，8min(速度1000r/s)离心后，去上清加含10％胎牛血清的DMEM培养基，吹打，取少许细胞滴片检测Thy-1，剩余细胞调整浓度至3×105个/mL，接种到准备好的骨髓间充质干细胞和支持细胞饲养层上，分别作为实验组1(E-1)和实验组2(E-2)。 ⑤ELISA法检测对照组、实验组1培养液中的白血病抑制因子(LIF)。隔日换液，并收集两组上清液，冻存于-20℃低温冰箱中储存，直至SSCs进入指数增长期后。将两组上清液解冻作酶联免疫吸附(ELISA)实验，检测LIF的含量，两组进行对比，并作统计分析。 ⑥对比以骨髓间充质干细胞为饲养层和支持细胞为饲养层体外培养的SSCs增殖情况。在培养瓶自建坐标，在四个象限分别选相应的四个固定视野，每日拍照并计数SSCs，直至两组SSCs都达到指数增长期后，对比两组SSCs增殖情况，最后利用SSCs表面特异性标志物Thy-1做免疫组织化学鉴定。 结果： ①培养4h，见骨髓间充质干细胞已开始贴壁，培养7d时，见细胞铺满瓶壁面积的70％-80％，细胞排列紧密，此时骨髓间充质干细胞铺成单层；H-E染色见细胞多为长梭型，有突起及分支，胞体大，核一个，较大，呈圆形，着色浅；骨髓间充质干细胞表面标志物CD44免疫组织化学阳性； ②对照组的骨髓间充质干细胞上清液中LIF的含量较对照组高。 ③精原干细胞在支持细胞和骨髓间充质干细胞为饲养层上均能够保持非分化增殖，且在骨髓间充质干细胞上增殖的速度较在支持细胞上增殖的速度快，且细胞生长状态良好。证明在SSCs培养中骨髓间充质干细胞是一种较好的饲养支持体。 结论： ①利用全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞，结合差速贴壁纯化骨髓间充质干细胞，使该方法为体外成功培养人胎儿骨髓间充质干细胞提供技术方法； ②骨髓间充质干细胞所分泌白血病抑制因子，能在体外有效促进精原干细胞增殖和维持其非分化状态； ③骨髓间充质干细胞作为饲养层培养精原干细胞优于支持细胞。

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精原干细胞分化及自我更新调控机制研究进展 综述

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