环状RNA在胃癌发生中的作用及其诊断价值分析

摘要

研究目的： 环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种内源性共价闭合环形RNA，在多种生命活动中发挥着重要作用，特别是也参与了肿瘤的发生与发展过程。研究表明，circRNA在不同种类的癌症组织以及细胞株中呈现差异性表达，并且，其表达情况与这些疾病的状态和预后情况密切相关。胃癌一直是我国发病率和死亡率最高的癌症之一，其中，早期诊断困难是造成胃癌患者治愈率低下和生存时间短暂的重要原因。因此，基于circRNA具有环形结构而较稳定的特殊性，本论文探索了其作为胃癌临床诊断标志物的可能性，并进一步研究胃癌相关circRNA在胃癌的发生和发展中所起的作用。 研究方法： 1.结合circRNA芯片和circRNA数据库，筛选胃癌相关circRNA。 2.应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术，检测127对胃癌组织及其癌旁组织中hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282的表达水平；检测5株胃癌细胞株和1株正常胃黏膜上皮细胞株中hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282的表达水平；检测34例正常胃黏膜组织和51例胃炎组织中hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282的表达水平。结合胃癌患者临床病理资料，分析它们在临床诊断中的价值，筛选有效的胃癌分子诊断标志物。 3.应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术对hsa_circ_0006282在细胞株进行干扰后，研究该细胞株生物学功能的变化。 4.运用实时细胞分析仪(real-time cellular analysis,RTCA)和流式细胞仪分别检测下调hsa_circ_0006282后细胞生长能力、细胞周期和细胞凋亡的变化；运用Transwell实验、细胞克隆实验分别检测下调hsa_circ_0006282后细胞迁移能力和增殖能力的变化； 5.运用Western blot实验检测下调hsa_circ_0006282后与细胞生物学功能改变相关的蛋白质表达水平的变化。 6.构建过表达circRNA重组载体，用慢病毒转染技术包装形成稳定上调hsa_circ_0006282的细胞株。 研究结果： 1.qRT-PCR实验结果表明，hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282在胃癌组织、胃癌细胞株以及胃炎组织中均为低表达,并且，它们的ROC曲线下面积分别为0.630和0.655。临床病理资料分析表明，hsa_circ_0074362表达水平与肿瘤标志物CA19-9（carbohydrate antigen19-9）（P=0.027）和淋巴结转移（P=0.039）存在一定的关系，hsa_circ_0006282与肿瘤标志物CA19-9（P=0.034）存在一定的关系；故两种circRNA在临床诊断中均有一定的诊断价值。 2.RTCA实验结果表明，下调hsa_circ_0006282后细胞生长能力增强(P＜0.05)；细胞克隆实验结果表明，下调hsa_circ_0006282后细胞增殖能力增强；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡实验结果表明，下调hsa_circ_0006282后细胞凋亡减少，且细胞阻止于G1期；Transwell实验结果表明，下调hsa_circ_0006282后细胞迁移能力增强(P＜0.05)。 3.Western Blot实验结果表明，下调hsa_circ_0006282后细胞内细胞周期依赖性激酶2（cyclin dependent kinase2,CDK2）表达水平明显增加；在胃癌细胞株中，PI3K/AKT信号通路中的关键蛋白AKT和PI3K的表达水平明显增加，同时该通路的负反馈调控分子PTEN蛋白的表达水平明显降低。 4.circRNA重组载体转入细胞后成功表达出绿色荧光蛋白，且能稳定上调hsa_circ_0006282的表达水平。 研究结论： 1.胃癌相关hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282在胃癌组织和胃癌细胞中均为低表达，在临床诊断中具有一定的诊断价值，具有作为肿瘤标志物的潜能。 2.生物学功能实验表明，下调hsa_circ_0006282后，细胞生长能力、增殖能力、迁移能力和抗凋亡能力均增强，且细胞周期中G1期细胞明显增多。 3.Western Blot实验结果表明，下调hsa_circ_0006282后，细胞生长能力和增殖能力的增强可能与CDK2的表达水平升高有关，而肿瘤细胞的抗凋亡能力和迁移能力增强则可能与PI3K/PTEN/AKT信号通路的活化有关。 4.过表达载体的成功构建，为进一步研究上调hsa_circ_0006282对细胞生物学功能的影响打下基础。

目录

声明

引言

1研究内容和技术路线

1.1研究内容

1.1.1筛选胃癌相关circRNA

1.1.2检测胃癌相关circRNA在胃癌组织、胃癌细胞以及胃炎组织中的表达水平

1.1.3结合胃癌患者的临床病理资料，分析相关circRNA的诊断价值

1.1.4下调hsa_circ_0006282，检测细胞增殖、周期、凋亡等生物学功能的变化

1.1.5下调hsa_circ_0006282，检测相关蛋白表达水平的变化

1.1.6构建circRNA过表达载体

1.2技术路线

2材料与方法

2.1材料

2.1.1主要仪器

2.1.2主要试剂

2.1.3组织标本

2.1.4细胞株和载体

2.2方法

2.2.1样本的收集与存储

2.2.2总RNA的提取与逆转录

2.2.3 circRNA的引物设计与合成

2.2.4 qRT-PCR检测目的基因的表达水平

2.2.5细胞培养

2.2.6小干扰RNA的合成

2.2.7瞬时转染

2.2.8实时细胞分析仪（RTCA）检测细胞的生长能力

2.2.9细胞克隆检测细胞的增殖能力

2.2.10 Transwell实验检测细胞的迁移能力

2.2.11流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

2.2.12Western blot检测相关蛋白质的表达水平

2.2.13 circRNA过表达载体的构建

2.2.14慢病毒包装

2.2.15统计分析

3实验结果

3.1胃癌相关circRNA的筛选

3.1.1胃癌相关circRNA的芯片筛选

3.1.2 hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282的来源与特点

3.2胃癌相关circRNA的表达

3.2.1 hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282在胃癌组织中低表达

3.2.2 hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282在胃癌细胞中低表达

3.2.3 hsa_circ_0074362和hsa_circ_0006282在胃炎组织中低表达

3.3胃癌相关circRNA的诊断价值分析

3.3.1 hsa_circ_0074362的诊断价值分析

3.3.2 hsa_circ_0006282的诊断价值分析

3.4下调hsa_circ_0006282对胃癌细胞生物学功能的影响

3.4.1下调hsa_circ_0006282对细胞生长能力和增殖能力的影响

3.4.2下调hsa_circ_0006282对细胞迁移能力的影响

3.4.3下调hsa_circ_0006282对细胞周期和凋亡的影响

3.4.4下调hsa_circ_0006282对相关蛋白质表达的影响

3.4.5 hsa_circ_0006282过表达载体的构建

4讨论

参考文献

附录A 缩略词

附录B 综述:环状RNA的生物学功能及其在肿瘤发生中的作用

在学研究成果

致谢