石榴果皮提取物对食品腐败菌的抑菌活性及机理研究

摘要

据统计，全世界每年有20％左右的肉制品损失于各种腐败变质。这不仅导致经济上的损失，更危及消费者的健康和生命。其中微生物污染是导致食品腐败变质的主要原因之一。本论文以石榴加工中的副产物—石榴果皮为材料，以食品中的常见腐败菌为供试菌，以抑菌圈直径和MTT清除率为活性追踪指标，对石榴果皮中抑菌活性物质的抑菌特性、成分分析、提取的工艺条件及抑菌机理进行了系统的研究，研究结果为石榴果皮工业化开发利用和研制新型食品防腐剂提供了理论和技术依据。本论文主要研究结果如下:
　　(1)对石榴果皮提取物抑菌活性初步研究结果表明，石榴果皮乙醇提取物对九种食品腐败菌均有抑制作用，其中对溶酪大球菌、藤黄微球菌和变形杆菌的抑制作用最为显著。对各供试菌的抑制效果依次为:溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)＞藤黄微球菌(Micrococcus luteus)＞变形杆菌(Proteusbacillusvulgaris)＞腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)＞枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、大肠杆菌(Escherichia coli＞荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)＞白色链球菌(Monilia albican)。
　　(2)采用药物平板稀释法研究了石榴果皮乙醇提取物对九种食品腐败菌的最低抑制浓度(MIC)（以生药量计），实验结果表明:石榴果皮乙醇提取物对溶酪大球菌和藤黄微球菌的抑制作用最强，其MIC值为12.5mg/mL;对腐生葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌的MIC值为25.0mg/mL;对枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞杆菌的MIC值为50.0mg/mL;对白色链球菌的MIC值为100.0mg/mL。
　　(3)采用药物平板稀释法研究了石榴果皮乙醇提取物各萃取相对溶酪大球菌和藤黄微球菌的抑菌活性。结果表明正丁醇萃取物具有显著的抑菌效果，对溶酪大球菌和藤黄微球菌的MIC值（以生药量计）均为12.5mg/mL，较之未经萃取的石榴果皮乙醇提取物对这两种菌MIC值没有变化，乙酸乙酯萃取物抑菌活性较弱，对溶酪大球菌的MIC值为50.0mg/mL，对藤黄微球菌的MIC值为25.0mg/mL，剩余水层物质几乎没有抑菌活性。以上实验表明石榴果皮乙醇提取物主要抑菌活性物质集中于正丁醇萃取物中。
　　(4)以溶酪大球菌为指示菌，研究了热处理和紫外照射处理对石榴果皮正丁醇萃取物抑菌活性的影响。结果表明高温处理和紫外照射对石榴果皮正丁醇萃取物的抑菌活性几乎没有影响。
　　(5)综合运用现代色谱学技术（大孔树脂柱层析色谱、硅胶柱层析色谱、Sephadex LH-20色谱、高效液相色谱）从石榴果皮正丁醇萃取物中分离得到1种单体化合物。对化合物的鉴定和分析，得出此化合物为异槲皮苷。
　　(6)以异槲皮苷的含量为指标，采用乙醇回流提取法对石榴果皮中异槲皮苷的提取工艺参数进行单因素试验，通过正交法得出对石榴果皮抑菌活性物质提取效果影响的大小顺序为:乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比;其最佳提取条件为:乙醇浓度90％，提取温度80℃，提取时间2.5h，料液比1∶15。在此优化条件下，得到的异槲皮苷的含量为2.36％。
　　(7)正常组和加药组溶酪大球菌生长曲线对比结果表明，石榴果皮正丁醇萃取物能够抑制溶酪大球菌对数生长期的菌体分裂;呼吸抑制试验结果表明，石榴果皮正丁醇萃取物主要是抑制HMP途径，导致还原力NADPH缺乏，引起代谢功能障碍，从而达到抑菌的目的;通过测定碱性磷酸酶AKP结果表明，石榴果皮正丁醇萃取物造成溶酪大球菌细胞壁的通透性增加，从而破坏细胞结构的完整性;通过透射电镜观察，经石榴果皮正丁醇萃取物作用后菌体内部结构发生变化，细胞壁结构被破坏，出现质壁分离的现象。综上所述，石榴果皮正丁醇萃取物的抑菌机理主要是其抑制了菌体的HMP途径，引起代谢功能障碍，抑制呼吸代谢酶的合成，引起细胞质固缩，最终使菌体生长繁殖受到抑制，甚至死亡。

目录

声明

致谢

摘要

第1章 引言

1．1 石榴的研究开发现状

1．1．1 石榴的生物学特性

1．1．2 我国石榴资源及其分布

1．1．3 石榴的营养价值

1．1．4 石榴的生理活性

1．1．5 石榴的化学成分

1．2 常见食品腐败变质及防腐方法

1．3 植物薄防腐荆的研究进展

1．3．1 植物源防腐剂的来源

1．3．2 植物抑菌活性成分

1．3．3 植物源天然防腐剂的抑菌机理

1．4 立题依据与目的意义

第2章 石榴果皮粗提取及抑菌性能检测

2．1 实验材料、试剂与仪器

2．1．1 材料

2．1．2 菌种

2．1．3 试剂

2．1．4 仪器

2．2 实验方法

2．2．1 石榴果皮的提取

2．2．2 卡那霉素溶液的配制

2．2．3 培养基及含药培养基的制备

2．2．4 供试菌株的准备

2．2．5 供试菌种的保藏

2．2．6 石榴果皮乙醇提取物抑菌活性测定

2．2．7 石榴果皮乙醇提取物最低抑制浓度(MIC)的测定

2．3 结果与分析

2．3．1 石榴果皮乙醇提取物抑菌活性测定结果

2．3．2 石榴果皮乙醇提取物MIC测定结果

2．4 本章小结

第3章 石榴果皮萃取物的抑茵性能检测

3．1 实验材料、试剂与仪器

3．1．1 材料

3．1．2 菌种

3．1．3 试剂

3．1．4 仪器

3．2 实验方法

3．2．1 石榴果皮提取及分级萃取

3．2．2 石榴果皮萃取物抑菌活性测定

3．2．3 热处理对石榴果皮正丁醇萃取物抑菌活性的影响

3．2．4 紫外线照射对石榴果皮正丁醇萃取物抑菌活性的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 石榴果皮提取及分级萃取结果

3．3．2 石榴果皮萃取物抑菌活性测定结果

3．3．3 热处理对石榴果皮正丁醇萃取物抑菌活性的影响

3．3．4 紫外线照射对石榴果皮正丁醇萃取物抑菌活性的影响

3．4 本章小结

第4章 石榴果皮正丁醇萃取物的分离纯化及结构鉴定

4．1 实验材料、试剂与仪器

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 仪器

4．1．3 显色条件

4．2 实验方法

4．2．1 石榴果皮正丁醇萃取物化学成分分离

4．2．2 NMR测定

4．3 结果与分析

4．3．1 石榴果皮正丁醇萃取物抑菌活性测定

4．3．2 正丁醇萃取物化学成分分离结果与分析

4．3．3 化合物结构和名称

4．4 本章小结

第5章 异槲皮苷与天然防腐剂的抑茵性能比较

5．1 实验材料、试剂与仪器

5．1．2 材料

5．1．3 试剂

5．1．4 仪器

5．2 实验方法

5．2．1 MTT微量抑茵测定

5．2．2 异槲皮苷与天然防腐剂的MIC值测定

5．3 结果与分析

5．3．1 异槲皮苷与天然防腐剂的MIC值测定结果

5．4 本章小结

第6章 石榴果皮中异槲皮苷提取工艺研究

6．1 实验材料、试剂与仪器

6．1．1 材料与试剂

6．1．2 仪器

6．2 实验方法

6．2．1 单因素试验

6．2．2 正交试验

6．3 结果与分析

6．3．1 乙醇回流法提取异槲皮苷单因素试验

6．3．2 正交试验及最佳提取工艺优化

6．4 本章小结

第7章 石榴果皮正丁醇萃取物的抑茵机理研究

7．1 实验材料、试剂与仪器

7．1．2 材料

7．1．3 试剂

7．1．4 仪器

7．2 实验方法

7．2．1 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌生长曲线的绘制

7．2．2 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌利用糖的影响

7．2．3 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌蛋白含量的影响

7．2．4 呼吸代谢的抑制试验

7．2．5 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌细胞壁的影响

7．2．6 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌琥珀酸脱氢酶的影响

7．2．7 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌苹果酸脱氢酶的影响

7．2．8 透射电镜观察试验

7．3 结果与分析

7．3．1 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌生长曲线的影响

7．3．2 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌利用糖的影响

7．3．3 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌蛋白含量的影响

7．3．4 呼吸代谢的抑制试验

7．3．5 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌细胞壁的影响

7．3．6 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌琥珀酸脱氢酶的影响

7．3．7 石榴果皮正丁醇萃取物对溶酪大球菌苹果酸脱氢酶的影响

7．3．8 透射电镜观察结果

7．4 本章小结

第8章 结论与展望

8．1 结论

8．2 创新

8．3 展望

参考文献