靶向siRNA体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS 基因表达的研究

摘要

目的：探讨体外直接转染以大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F) MAS基因为靶标的小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)后, NRK-49F的MAS基因的mRNA表达和蛋白水平是否受到抑制,筛选出高效的siRNA,为进一步研究MAS基因在肾脏疾病中的作用机制提供实验基础。方法：(1)靶向MAS基因的siRNA的设计及合成：通过NCBI检索大鼠MAS基因序列,按照siRNA序列设计原则设计并合成特异性沉默MAS的siRNA3对：siRNA-1(5'-CCUGACCAGA GCUUUCAAATT-3',5'-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3')、siR NA-2(5'- GACCAAUCAAAUAUGACAUTT - 3',5'- AUGUCAUA UUUGAUUGGUCTT-3')、siRNA-3(5'-GCCAUUACUACACAAUC GUTT-3',5'-ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT-3')；阴性对照siRNA (siRNA-neg)(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',5'-ACGU GACACGUUCGGAGAATT-3')1对。(2)细胞培养：NRK-49F细胞置于DMEM /F12培养基中(含有l0%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素),在37℃、5%CO2的无菌培养箱中,用0.25%胰酶消化传代,待细胞悬液内的细胞呈对数生长后,将细胞制成1×105/ml的细胞悬液接种于6孔培养板进行实验。(3)实验分组：①MAS siRNA-1 ： 加 入 含 siRNA 序 列 1 的 转 染 混 合 物(transfection complexes,TC)；②MAS siRNA-2：加入含siRNA序列2的TC；③MAS siRNA-3：加入含siRNA序列3的TC；④ 阴性对照组(CG)：加入含siRNA阴性序列的TC；⑤ 空白对照组(NG)：只加入转染试剂；每组设3个复孔。(4)转染：将HiPerFect Transfection Reagent 12ul与无血清无双抗培养液混合,配成100ul转染液后,再加入终浓度为10nM的siRNA,两者混匀常温孵育5-10分钟。将转染混合物加入六孔板中,轻轻晃动保证转染混合物分布均匀,恒温箱中孵育,48小时后检测转染效率。(5)基因表达检测：应用反转录酶聚合酶链式反应( rever-setranscription -polymerase chain reaction , RT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后MAS的mRNA与蛋白表达的变化。(6)图像处理：采用Quantity One 4.4.0软件测定各组灰度值。(7)统计分析：应用软件spss17.0进行统计学分析,通过单因素方差分析检验各组间差异性,P<0.05视为有统计学意义。结果：经siRNA干扰后,3条靶向siRNAs均能不同程度的抑制MAS基因的表达。RT-PCR方法检测结果显示siRNA-1组、siRNA-2组及siRNA-3组NRK-49F细胞MAS的mRNA水平与空白对照组相比显著降低(P〈0.05) , 各组 MAS 与 GAPDH 灰度值的比值分别为0.5772±0.0220 , 0.3380±0.0434 , 0.6164±0.0767 ,抑制率分别达到26.89%,57.12%,21.73%,而阴性对照组和空白对照组之间mRNA的表达水平比较则无显著下降。Western blot 方法检测结果显示：3条靶向MAS的特异性序列siRNA蛋白表达水平与空白对照组相比显著降低(P〈0.05),抑制率分别为 59.47%,67.81%,50.32%,而阴性对照组和空白对照组之间蛋白的表达水平则无明显差异,与RT-PCR结果基本一致。结论：1.体外转录合成的靶向MAS基因的siRNA可通过阳离子复合物介导瞬时转染至大鼠肾间质成纤维细胞,并发挥基因抑制的作用。2. 成功筛选出一组能够高效率特异性沉默大鼠肾间质成纤维细胞MAS基因的siRNA。

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前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 主要溶液的配制

3 实验方法

结果

1 正常NRK-49F细胞形态

2 RT-PCR检测结果

3 Western blot检测结果

讨论

1. MAS受体的作用

2．siRNA的合成及转染方法的研究

3. siRNA沉默基因效果的研究

结论

参考文献

中英文缩略词对照表

致谢

siRNA的合成及导入方法研究进展

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