靶向siRNA体外抑制肝癌HepG-2细胞VEGF-B基因表达的研究

摘要

目的：原发性肝癌(简称肝癌)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，手术切除是目前治疗肝癌首选和最有效的方法。但肝癌患者临床症状出现较晚，症状出现后大多数患者已处于中晚期，手术切除率低，预后差。术后肿瘤的转移和复发是影响患者长期生存的首要原因。肿瘤的生长及转移需要新生血管的生成，血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growthfactor family members，VEGFs)可以直接或间接作用于每一个环节促进血管生长。迄今为止发现的VEGF家族有7个成员，包括VEGF-A(即通常所说的VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(又称viralVEGF)、VEGF-F(又称snake venom VEGF)以及PLGF(胎盘生长因子placenta growth factor)。除了VEGF-E、VEGF-F外，其它VEGF家族成员均由哺乳动物基因编码。VEGF家族在脊椎动物中存在广泛的表达，在不同的物种中其编码序列高度保守。VEGF家族成员及其受体在众多肿瘤组织尤其是实体肿瘤组织(如肝癌)中存在异常表达，并与肿瘤的侵袭、转移、复发等生物学特性密切相关。VEGF-B是VEGF家族成员之一，在各种不同的肿瘤组织中存在异常表达，在肿瘤的侵袭、转移方面起着重要的作用。我们的前期研究显示：VEGF-B在肝癌的生长、侵袭及转移中起重要作用，并与肝癌患者的预后密切相关。因此，抑制VEGF-B基因的表达可望抑制肝癌细胞的增殖、转移。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近些年发展起来的一项新技术，RNA干扰的原理是将与内源性mRNA同源的外源性双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)经不同途径导入体内或体外的组织细胞，致使特定基因沉默。小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)是RNA干扰的主要效应因子。利用质粒或病毒为载体，将基因靶向siRNA导入细胞内，可对特定基因产生沉默效应。本研究以VEGF-B为靶点，体外构建靶向VEGF-B siRNA表达质粒载体，并转染肝癌细胞HepG-2，用逆转录聚合酶链式反应技术(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)检测分析实验组和对照组VEGF-BmRNA的表达，研究靶向VEGF-B siRNA对肝癌细胞HepG-2 VEGF-B基因的抑制作用，为肝癌的基因治疗提供新的靶点和方法，为临床应用提供理论依据。
　　方法：扫描分析人类VEGF-B编码序列，设计合成靶向VEGF-B siRNA，利用大肠杆菌进行质粒扩增和提取；人肝癌细胞株HepG-2置于DMEM培养基中(含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)，在37℃、5%CO2的无菌培养箱中，视细胞生长状态及培养基颜色换液培养。待细胞培育至呈对数生长，用2.5 g/L胰酶消化并将细胞接种于6孔培养板，待细胞铺满率达80%后，按转染试剂说明书用Lipofectamine2000将实验组及对照组质粒分别转染HepG-2细胞，于24～48小时在荧光显微镜下观察转染效率并收取细胞。以Trizol一步法提取细胞总RNA，用RT-PCR技术分析实验组及对照组肝癌细胞VEGF-B mRNA的表达(以β-action作为内参照标准)。
　　结果：
　　1、将重组的靶向VEGF-B siRNA质粒转入大肠杆菌进行扩增，利用高纯度小量质粒提取试剂盒，可成功提取纯度较高的靶向VEGF-B siRNA质粒。
　　2、以质粒(含荧光标记)为载体，可将靶向VEGF-B siRNA成功转染人肝癌细胞HepG-2，于荧光显微镜下观察，实验组及对照组转染效率均达80%以上。
　　3、将人肝癌细胞株HepG-2转染靶向VEGF-B siRNA后，与对照组相比，各实验组VEGF-B的基因扩增产物电泳条带亮度呈不同程度的减低(以β-action作为内参照标准)；对照组、实验组1、实验组2、实验组3的VEGF-B的基因扩增产物电泳条带亮度与内对照β-action的比值分别为：0.396±0.037、0.135±0.019、0.271±0.011、0.222±0.030。各实验组VEGF-B mRNA的表达量显著低于对照组VEGF-B mRNA(P<0.05)。靶向VEGF-B siRNA可抑制HepG-2细胞VEGF-B mRNA的表达。
　　结论：
　　靶向VEGF-B siRNA在体外抑制肝癌HepG-2细胞VEGF-B mRNA的表达。