直接连接法制备携尿激酶RGDS造影剂微泡靶向溶解在体血栓的实验研究

摘要

目的：研究制备携带尿激酶（UK）及精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸（RGDS）肽段靶向溶栓超声微泡造影剂的可行性，并评价其理化性质及所携带尿激酶的活性。探讨不同浓度的FeCl3和不同方法对制备兔股动脉内闭塞性、以血小板为主的混合性血栓的影响因素，为溶栓研究提供稳定、方便的血栓模型。探索与血栓特异性靶向结合的超声微泡携带药物溶解血栓的靶向性和有效性。
　　 方法：尿激酶和RGDS进行荧光双标记，根据尿激酶/RGDS 1∶1、2∶1和1∶2不同比例实验分为三组，以声诺维（SonoVue）为载体，通过直接连接法，制备亲血栓同时携带溶栓药物的超声微泡造影剂，并检测三组微泡大小、形态、荧光亮度，微泡与尿激酶及RGDS的结合率以及所携带尿激酶的活性。30只新西兰大白兔总60条股动脉，分别予以不同浓度的Fecl3（＜10%FeCl3，10%FeCl3，＞10%FeCl3）、外敷法和内注射法以及股动脉远端有无夹闭等影响因素将动物分为三组，观察血栓形成情况，并对血管行HE染色和免疫组化血管假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）染色。42只新西兰大白兔单侧股动脉制作富含血小板的混合性血栓，分成7组，每组6只：1）单纯超声照射组（US）；2）超声照射+造影剂注射组（US+M）；3）单纯尿激酶静脉注射组（UK）；4）超声照射+微泡造影剂+尿激酶静脉注射组（US+M+UK）；5）超声照射+RGDS微泡造影剂组（US+R）；6）RGDS微泡造影剂+尿激酶静脉注射组（R+UK）；7）超声照射+RGDS微泡造影剂+尿激酶组（US+R+UK）。将 RGDS、微泡造影剂（SonoVue）和尿激酶通过直接联合法，按1∶1∶1配制6ml的溶液。3ml在5min内团注，3ml在20min内静脉缓慢推注，超声照射30min。120min后，通过超声检测、血流量测量和病理结果分析来对血栓的靶向性及溶栓效果进行评价。血流量持续监测120min后对血管的再通率和溶栓过程中血流频谱特点进行分析。
　　 结果：声诺维、尿激酶及RGDS三者可以稳定结合，以尿激酶和RGDS呈1：1比例配制的最佳。配制的造影剂在荧光显微镜下观察，洗涤前、后微泡表面均可发出绿色及橙红色荧光；流式细胞仪定量检测结果显示，洗涤前、后尿激酶携带率分别为73.4±11.0%、72.3±9.4%，RGDS携带率分别为67.1±10.9%、64.6±10.2%；体外血栓溶解实验证实所制备造影剂中尿激酶具有活性（P＜0.01），血栓溶解率为18.4±3.2%。外敷10%FeCl3形成闭塞性血栓优于其他浓度（P＜0.001），10%FeCl3外敷法形成血栓优于内注射法（P＜0.001），10%FeCl3外敷法联合远端夹闭形成血栓优于无夹闭的条件（P＜0.001）。在R+UK组和US+R+UK组，荧光显微镜下兔股动脉血栓部位同时显示标记RGDS的橙红色荧光和标记尿激酶的绿色荧光；UK、US、US+R、US+M组血流量＜基础血流量15%，均未实现溶栓后血管再通；US+M+UK、R+UK组血流量在基础血流量的15%～49%之间；US+R+UK组血流量＞75%基础血流量。120min后 US、UK、US+M、US+R及US+M+UK组均未实现再通（再通率＜15%），血流频谱未出现变化为小、低幅杂波；R+UK组实现部分再通（再通率41.61%），US+R+UK完全再通（再通率85.81%），溶栓时血流频谱出现持续高幅、杂乱的波（P＜0.001），在US+R+UK组出现超声波与血流频谱出现高幅、杂乱的共振变化血流量实现完全再通。
　　 结论：应用直接连接法可以制备同时携带尿激酶及RGDS的靶向溶栓超声微泡造影剂。外敷10%FeCl3外敷联合股动脉夹闭是成功形成股动脉内闭塞性、以血小板为主的混合性血栓的重要因素。应用直接联合法制备RGDS微泡造影剂携带尿激酶对血栓具有靶向性，并能溶解兔股动脉在体血栓。

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文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略词对照表

声明

前 言

第一部分携尿激酶及RGDS靶向溶栓超声微泡造影剂制备的实验研究

第二部分外敷FeCl3形成兔股动脉闭塞性、混合性血栓

第三部分直接连接法制备携尿激酶RGDS造影剂微泡靶向溶解在体血栓的实验研究

全文总结

致 谢

参考文献

个 人 简 历

攻读博士学位期间发表的学术论文