叶酸在甲基硝基亚硝基胍致哈萨克族食管上皮永生化细胞表遗传改变中的作用

摘要

目的：探讨叶酸在甲基硝基亚硝基胍（MNNG）对哈萨克族正常食管上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标改变中的作用，为哈萨克族食管癌的防治提供理论依据。
　　方法：采用3*3析因设计将体外培养的哈族食管正常上皮细胞暴露于不同浓度叶酸(0.00μg/ml、0.40μg/ml、0.80μg/ml)和MNNG(0.00μg/ml、0.75μg/ml、1.50μg/ml)的培养液中作用48h、72h和96h后，1.采用噻唑蓝（MTT）法测定不同叶酸浓度下MNNG对哈族食管上皮细胞增殖的影响；2.采用高效液相色谱法（HPLC）测定基因组DNA整体甲基化水平改变；3.采用亚硫酸氢盐测序（BSP）法检测MTHFR、FRα基因甲基化状态；4.采用RT-PCR及Western Blot法检测MTHFR、FRα、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA及蛋白表达。
　　结果：随着叶酸浓度的降低、MNNG浓度的增加以及作用时间的延长，（1）哈族食管正常上皮细胞形态发生了明显的变化，即死细胞数目逐渐增多，细胞核出现不同程度的破裂，胞质不匀和细胞完整性损伤，细胞对MNNG损害的敏感性明显增加，96h时尤为严重；（2）哈族食管正常上皮细胞的抑制率升高，存在显著性差异（P<0.01）；（3）哈族食管正常上皮细胞的整体甲基化水平降低，存在显著性差异（P<0.01）；（4）哈族食管正常上皮细胞的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b酶活性均升高，均存在显著性差异（P<0.01）；（5）哈族食管正常上皮细胞的MTHFR、FRα甲基化频率均升高，其中MTHFR启动子区P1-1片段、P1-2片段及FRα启动子区P2-1片段表现较为明显，均存在显著性差异（P<0.01）；（6）哈族食管正常上皮细胞的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA及蛋白表达水平均升高，MTHFR、FRα基因mRNA及蛋白表达水平则均降低，均存在显著性差异（P<0.01）。
　　结论:叶酸浓度降低对MNNG致哈族食管正常上皮细胞损伤有一定的促进作用，而保持充足的叶酸则对MNNG的损害起到一定的保护作用。

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中英文缩略词对照表

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中文摘要

英文摘要

前言

研究内容与方法

1 实验材料及试剂

2 实验方法

3 质量控制

4 数据及统计学处理

5 技术路线

结果

1 哈族永生化正常食管上皮细胞形态

2 哈族食管正常上皮细胞生长曲线

3 染毒剂量确定

4 细胞一般生物学特性

5 基因组DNA甲基化水平检测

6 DNA甲基转移酶活性

7 MTHFR、FR基因甲基化状态

8 MTHFR、FRα、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA表达

9 DNMT1、DNMT3a 、DNMT3b、MTHFR及FRα蛋白表达水平

讨论

1 不同浓度叶酸作用下MNNG对哈族食管上皮细胞增值的影响

2 不同浓度叶酸作用下MNNG对DNA整体甲基化水平的影响

3 不同浓度叶酸作用下MNNG对DNA甲基转移酶活性的影响

4 不同浓度叶酸作用下MNNG对MTHFR和FRα基因甲基化的影响

5不同浓度叶酸作用下MNNG对基因表达水平的影响

6 问题与展望

小结

致谢

参考文献

综述:叶酸及一碳单位代谢通路相关基因表观遗传修饰与肿瘤的关系

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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