未羧化骨钙素对氟致糖代谢紊乱的调节作用

摘要

本文研究了未羧化骨钙素对氟致糖代谢紊乱的调节作用。本研究分为三个部分：
　　第一部：分过量氟对机体内骨钙素含量与糖代谢的影响。
　　目的：探讨不同剂量氟作用于机体后对骨钙素及糖代谢的影响。
　　方法：⑴选取确诊为氟骨症的65例患者为氟骨症组，诊断无骨病变且排除相关骨骼疾病的其他65例病人作对照组。记录一般情况，计算体质指数(Body Mass Index,BMI)，酶联免疫吸附实验法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清总骨钙素(total Osteocalcin,tOCN)、未羧化骨钙素(uncarboxylated Osteocalcin,ucOCN)、空腹胰岛素(Fasting Insulin,FINS)含量，化学法测定血糖(Glucose,GLU)、糖化血清蛋白(Glycated serum protein,GSP)含量，计算胰岛素抵抗指数(Insulin resistence index,HOMA-IR)。⑵18-24g的C57雄性小鼠36只分为3组，0mg/L、100 mg/L、150 mg/LNaF干预，2、4、6、8、10、12 W后检测体质量。12W后化学发光法检测血糖、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin,HbA1c)含量，ELISA法检测tOCN、ucOCN、FINS、胰高血糖素(Glucagon)含量。苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色观察胰腺病理学变化，免疫组化检测胰腺骨钙素(Osteocalcin,OCN)、周期蛋白D2(CyclinD2)的表达。
　　结果：①氟骨症组与对照组比较 ucOCN、FINS、GSP明显增高(P<0.05)。氟骨症组tOCN、HOMA-IR高于对照组，但无统计学意义(P>0.05)。氟骨症组GLU低于对照组无统计学意义。相关回归分析显示 ucOCN与 FINS呈正相关(P<0.05)。ucOCN与GLU、HOMA-IR呈负相关(P<0.05)，ucOCN与BMI、tOCN、GSP无相关性(P>0.05)。②各染氟组间tOCN、ucOCN含量比较差异均有统计学意义(F=32.31、17.41，P均<0.05)。其中各染氟组小鼠tOCN、ucOCN均高于对照组。组间GLU比较差异均有统计学意义(F=22.75,P均＜0.05)，其中各染氟组小鼠GLU均高于对照组。组间HbA1c、Glucagon、FINS含量比较差异均有统计学意义(F=102.40、73.61、5.32， P均<0.05)，其中各染氟组HbA1c、FINS均高于对照组。各染氟组Glucagon含量均低于对照组。ucOCN与tOCN、FINS呈正相关，与GLU、HbA1c呈负相关，与Glucagon无相关性；150 mg/L染氟组腺泡细胞形状偶见不规则，少量细胞界限稍模糊，部分胰岛细胞细胞核变少，分布较稀疏；染氟组小鼠胰腺中OCN表达呈阴性，CylinD2的表达呈阳性。
　　结论：⑴过量氟可导致氟骨症患者与小鼠血清ucOCN显著升高，表现为骨组织增殖的骨相损伤。⑵过量氟可导致氟骨症患者与小鼠糖代谢紊乱，表现为糖代谢异常的非骨相损伤。⑶过量氟作用时，ucOCN与FINS有相关性。
　　第二部分：不同剂量氟对体外培养胰岛β细胞功能的影响。
　　目的：观察不同剂量氟化钠(NaF)对体外培养的小鼠胰岛β细胞增殖活力和胰岛素(Insulin, INS)分泌的影响。
　　方法：0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/LNaF分别干预小鼠胰岛Beta-TC-6细胞24 h、48 h、72 h、96 h后，HE染色观察细胞形态，噻唑蓝(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl-2-H-TetrazoliumBromide,MTT)比色法检测细胞增殖活力；ELISA法测定胰岛素分泌变化。
　　结果：0.5 mg/L、1.0 mg/LNaF作用72 h时，可使胰岛β细胞增殖活力和胰岛素分泌较对照组明显增强(P?0.05)；≥8.0 mg/L时随着NaF剂量的增加和作用时间的延长，细胞增殖活力和胰岛素分泌明显减弱(P＜0.05)，且细胞生长逐渐缓慢，数量减少，不易贴壁或融合成片，多呈椭圆或圆形细胞。
　　结论：低剂量NaF促进胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌，随着剂量增大和时间延长，过量NaF对细胞增殖活力和胰岛素分泌能力的抑制逐渐增强，呈剂量效应关系。
　　第三部分：ucOCN-GPRC6A通路阻断后过量氟对体外培养胰岛β细胞功能的影响。
　　目的：阻断(未羧化骨钙素-G蛋白耦联受体 C家族6组成员 A,uncarboxylated Osteocalcin-G protein coupled receptor familyC,Group6,subtype A, ucOCN-GPRC6A)通路后，观察过量氟对体外培养小鼠胰岛 Beta-TC-6细胞 INS分泌、增殖能力的影响，探讨氟是否通过 ucOCN-GPRC6A通路影响小鼠胰岛β细胞功能。
　　方法：选取ucOCN-GPRC6A通路阻断和未阻断两组小鼠胰岛Beta-TC-6细胞，8 mg/LNaF、150 mmol/LucOCN、8 mg/L NaF+150mmol/LucOCN分别干预48 h，ELISA法测INS含量，提取总RNA、蛋白，RT-PCR、Western blot法检测CyclinD1、CyclinD2表达。
　　结果：⑴非转染：INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达NaF组较空白组显著降低(P?0.05)，ucOCN组INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达较空白组升高， NaF+ucOCN组INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达较空白组、ucOCN组降低，较NaF组升高。⑵转染：ucOCN组INS分泌水平、CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达较空白无显著差异。NaF+ucOCN组INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达较空白组降低(P0.05)，较NaF染毒组无统计学意义。⑶两组间比较：非转染 ucOCN组较转染 ucOCN组 INS分泌水平， CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达显著升高(P0.05)；非转染NaF+ucOCN组较转染NaF+ucOCN组INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达显著升高(P0.05)；非转染空白组、NaF染毒组与转染空白组、NaF染毒组INS分泌水平，CyclinD1、CyclinD2mRNA、蛋白的表达无显著差异。
　　结论：①ucOCN能够减轻过量氟对胰岛细胞的损伤效应。②氟可通过ucOCN-GPRC6A通路作用于胰岛细胞。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

技术路线图

第一部分 过量氟对机体内骨钙素含量与糖代谢的影响

第一节 氟骨症患者体内骨钙素与糖代谢的变化

第二节 氟中毒小鼠体内骨钙素与糖代谢的变化

第二部分 不同剂量氟对体外培养胰岛β 细胞功能的影响

研究内容与方法

结果

讨论

第三部分 ucOCN-GPRC6A通路阻断后过量氟对体外培养胰岛β 细胞功能的影响

研究内容与方法

结果

讨论

小结

致谢

参考文献

综述:过量氟对骨钙素与糖代谢相互作用关系的研究进展

攻读硕士学位期间发表的学位论文

导师评阅表