未羧化骨钙素对高糖条件下小鼠骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的调控效应

摘要

背景:寻找高糖条件下促进骨髓间充质干细胞成骨分化而抑制其成脂分化的方法,可以为治疗骨代谢疾病如糖尿病性骨质疏松提供预防及治疗思路。目的:探讨未羧化骨钙素对高糖条件下小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化和成骨分化的影响,揭示未羧化骨钙素对骨髓间充质干细胞分化的作用机制。方法:采用全骨髓细胞培养及贴壁纯化小鼠骨髓间充质干细胞,不同质量浓度(0,1,3,10,30μg/L)未羧化骨钙素处理细胞,CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,确定最佳作用质量浓度。第3代骨髓间充质干细胞加入成脂(或成骨)分化诱导培养基并分成4组:对照组、高糖处理组、未羧化骨钙素处理组、高糖+未羧化骨钙素处理组,分别添加25.5 mmol/L外源葡萄糖,3μg/L未羧化骨钙素进行处理。采用油红和茜素红染色检测脂滴和钙结节的形成,q RT-PCR检测成脂分化标志基因(Fabp4、PPARγ、Adipsin和FAS)和成骨分化标志基因(Runx2、Osx、ALP和COLⅠ)的相对表达水平,试剂盒检测碱性磷酸酶活性和Ⅰ型胶原蛋白水平。另外,结合MEK和AMPK的特异性抑制剂(PD98059和BML),Western blot检测P-Erk和P-AMPKα的相对表达水平。结果与结论:①3μg/L未羧化骨钙素可显著促进细胞增殖(P<0.01);②未羧化骨钙素促进高糖条件下骨髓间充质干细胞产生钙结节(P<0.01)而抑制脂滴的形成(P<0.05),下调成脂分化标志性基因(PFabp4<0.01;PPPARγ<0.05;PAdipsin<0.01;PFAS<0.01)而上调成骨分化标志性基因(PRunx2<0.05;POsx<0.05;PALP<0.01;PCOLⅠ<0.01)的表达,增加碱性磷酸酶活性(P<0.01)和Ⅰ型胶原蛋白水平(P<0.05);③高糖条件下,未羧化骨钙素上调P-Erk(P<0.01)和P-AMPKα(P<0.01)表达水平;④结果表明,未羧化骨钙素通过Erk/AMPKα信号通路促进高糖条件下骨髓间充质干细胞的成骨分化而抑制成脂分化。