基因修饰的鸡新城疫病毒FE株HN基因DNA疫苗的构建及其免疫效力的评价

摘要

为了寻求一种更加有效防控鸡新城疫病毒的途径，我们构建了NDV F<,48>E<,9>株的HN基因修饰的核酸疫苗，并通过体外表达实验和SPF鸡免疫实验对其进行了评估。 本研究利用密码子使用频率表，将NDV F<,48>E<,9>株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子，同时在HN基因的5’端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA[A/Goose/Guangdon/1/96(H5N1)HA gene，AccessionNo：AF 144305]蛋白信号肽序列。修饰后HN基因命名为SoptiHN，剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F<,48>E<,9>株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAXl和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAXl-CpG中，将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、pVC-HN，并用这些质粒转染293T细胞，48小时后间接免疫荧光和West-blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。随后，将重组质粒pVAXl、pVAXI-CpG、pV-HN、pVC-HN、pV-SoptiHN和pVC-SopfiHN采用四头肌多点注射三周龄SPF鸡，PBS设为空白对照组；一免后三周以相同的剂量加强免疫，二免后以10<'3>EID<,50> NDV的F<,48>E<,9>强毒株进行攻毒，计算发病率、死亡率、以及排毒情况。免疫及攻毒前后每周采集血清和外周血淋巴计算HI抗体和细胞因子IFN-γ和IL-18动态变化情况。 体外表达实验结果显示，与未经修饰的HN基因相比，修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高，并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。在随后的SPF鸡免疫实验中，实验结果显示，在攻毒前只有修饰过的HN基因免疫组的HI抗体滴度超过了2<'4>，pV-SoptiHN和pVC-SoptiHN分别为5.33±0.72和5.17±1.17，其余的免疫组都未能达到2<'4>。在随后的攻毒保护实验结果中也呼应了这一结果，pV-SoptiHN和pVC-SoptiHN免疫组都产生了71﹪的保护效率，而pV-HN和pVC-HN只有50﹪，空载体和空对照未能产生保护效力。我们从IFN-γ和IL-18检测的结果可以看到，pV-SopfiHN和pVC-SoptiHN诱导的细胞免疫水平高于其它免疫组。除空白组以外，其余的免疫组IFN-γ和IL-18表达水平在一免后一周升高，到二免一周达到最高峰，很快下降，攻毒后有很快上升但是没有超过二免一周的水平。在此过程中，我们发现，载体中包含CpG-ODN序列时可以诱导较高水平的细胞免疫。