新疆褐牛Toll样受体4外显子Ⅲ多态性与奶牛体细胞评分的相关性研究

摘要

Toll-样受体(Toll like receptors，TLRs)可以通过识别病原微生物启动天然免疫并激活适应性免疫。本研究以中国荷斯坦奶牛和新疆褐牛为研究对象，对TLR4基因外显子3进行了序列分析，并对发现的多态性位点进行PCR-RFLP分析，共发现TLR4 E3+1656、TLR4E3+2021和TLR4 E3+2414三个多态位点，其中TLR4 E3+1656位点发生T/C的碱基突变，但没有引起氨基酸变化；TLR4 E3+2021位点C/T的碱基突变，导致编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸；TLR4 E+2414位点发生G/A突变，引起氨基酸由精氨酸变为谷氨酸。但由于TLR4 E+2414位点只发现2个AB基因型个体，其余均为BB基因型个体，不具有统计意义，因此只对TLR4 E3+1656和TLR4E3+2021位点X2检验表明：两个品种这两个位点的突变均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。运用最小二乘法分析表明：TLR4 E3+1656位点的各基因型个体间的平均SCS差异不显著(P>0.05)；而TLR4E3+2021位点中AA与AB基因型SCS水平差异显著(P<0.05)，AA与BB基因型SCS水平差异极显著(P<0.01)，但AB与BB基因型SCS水平差异不显著(P>0.05)，说明TLR4E3+2021位点的AA基因型可能与抗乳房炎的抗性有关，A等位基因是乳房炎抗性的有利基因。为进一步研究TLR4 E3+2021位点不同基因型对奶牛SCS的影响，采用Quantitative Real-Time PCR技术检测了新疆褐牛不同基因型个体中TLRs信号通路下游的部分基因mRNA的表达水平，结果显示：NF-κB1、NF-κB2和IL-1β基因mRNA表达水平与TLR4 E3+2021位点AB和BB两种基因型差异显著(P<0.05)，TNF、TLR4、IL-10、IL-8、MD-2和Myd88基因mRNA表达水平与TLR4 E3+2021位点AB和BB两种基因型差异不显著(P>0.05)。这些结果提示我们TLR4 E3+2021位点碱基的改变可能引起了核内转录因子NF-κB表达量的变化，从而进一步导致IL-1β的mRNA表达量改变。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语中英文对照表

声明

第一章研究背景

1.1炎症研究进展

1.1.1概述

1.1.2炎症的分类

1.1.3炎症的原因及其影响因素

1.2奶牛乳房炎研究概况

1.2.1奶牛乳房炎的分类

1.2.2奶牛乳房炎的病因

1.2.3奶牛乳房炎的发病机理

1.2.4奶牛乳房炎的诊断

1.2.5体细胞评分(Somatic cell seore，SCS)

1.2.6乳房炎抗性功能基因的筛选及研究

1.3 TLRs(Toll-like Receptors)研究进展

1.3.1 TLRs的发现

1.3.2 TLRs结构及分布

1.3.3 TLRs成员及其配体

1.3.4 TLRs介导的信号传导通路

1.3.5 TLR4与疾病

1.4本试验中涉及的分子生物学方法

1.4.1限制性片断长度多态性

1.4.2实时定量PCR

1.5本试验的试验思路与意义

第二章采用测序技术对TLR4基因外显子3多态位点进行检测

2.1试验材料

2.1.1试验样本的采集

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要分析工具软件

2.1.4试验试剂

2.1.5试剂配制

2.2试验方法

2.2.1牛血液基因组DNA的提取

2.2.2琼脂糖凝胶电泳检测

2.2.3 TLR4基因外显子3的PCR扩增

2.2.4 PCR产物的检测

2.2.5 PCR产物胶回收(杭州博日试剂盒)

2.3结果与分析

2.3.1牛血液基因组DNA提取结果

2.3.2 TLR4基因外显子3 PCR扩增结果及测序结果

2.4讨论

2.4.1 DNA提取的优化

2.4.2对试验中所采用的PCR产物直接测序方法的讨论

第三章TLR4基因外显子3多态性位点的PCR-RFLP检测

3.1试验材料

3.1.1试验样本的采集

3.1.2主要仪器设备

3.1.3主要分析工具软件

3.1.4试验试剂

3.1.5试剂配制

3.2试验方法

3.2.1牛血液基因组DNA的提取

3.2.2 TLR4基因外显子3多态性位点的PCR-RFLP检测

3.3结果与分析

3.3.1 TLR4基因外显子3多态位点PCR-RFLP结果

3.3.2 TLR4基因外显子3TLR4 E3+1656和E3+2021位点等位基因频率和基因型频率

3.3.3 TLR4基因外显子3 TLR4 E3+1656和E3+2021位点在奶牛群体中的遗传特性

3.3.4 TLR4基因外显子3酶切多态性与奶牛乳房炎的关联分析

3.4讨论

3.4.1关于TLR4基因多态性及群体遗传分析

3.4.2 TLR4基因多态性与奶牛乳房炎的关系

3.4.3 TLR4基因多态性与奶牛品种和年龄的关系

第四章处于TLR信号通路上相关基因的定量分析

4.1试验材料

4.1.1试验样本的选择

4.1.2主要仪器设备

4.1.3主要分析工具软件

4.1.4试验试剂

4.1.5试剂配制

4.2试验方法

4.2.1总RNA的提取及检测

4.2.2 RT-PCR制备cDNA及其纯化

4.2.3 TLR4 E3+2021位点不同基因型个体的基因表达定量分析

4.3结果与分析

4.3.1牛血液总RNA提取结果

4.3.2目的基因cDNA片段普通PCR产物电泳

4.3.3目的基因质粒DNA线性化

4.3.4基因测序结果

4.3.5基因标准曲线

4.3.6 Quantitative Real-Time PCR扩增曲线

4.3.7基因熔解曲线

4.3.8基因表达量与不同基因型个体的相关分析

4.4讨论

4.4.1关于RNA操作的讨论

4.4.2关于Quantitative Real-Fime PCR

4.4.3TLR4基因多态性与基因mRNA表达量的关系

第五章结论

参考文献

致谢

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