犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究

摘要

犬细小病毒感染是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一种高度接触性传染病。其传播速度快，发病率和死亡率高，对家犬、经济动物及野生动物危害很大。目前，该病尚无有效的治疗方法。对其防治主要以弱毒疫苗免疫预防为主，但弱毒疫苗在使用过程中存在不安全问题，因此，急需一种安全有效的新型疫苗来预防该疾病。由于CPV的主要抗原位点位于VP2蛋白上，因此，VP2基因及其编码蛋白已成为研究犬细小病毒的热点。本研究工作主要包括以下四部分：
　　 1．犬细小病毒巢式PCR检测方法的建立及应用
　　 从临床上疑似感染CPV的犬粪便中提取总DNA。根据GenBank已发表的CPV特异保守的VP2基因序列设计二对引物，扩增出目的条带，进行测序。结果表明与国际标准的CPV VP2基因序列的同源性为99.3~100%。通过摸索重复性、特异性、敏感性试验，建立了巢式PCR方法。此方法具有良好的特异性和敏感性，适合于犬细小病毒的检测和分子流行病学调查。
　　 2．犬细小病毒VP2基因的克隆及序列分析
　　 根据GenBank中已发表的犬细小病毒基因序列，设计一对特异性引物，以巢式PCR检测的阳性样品DNA为模板，经PCR扩增，获得目的基因，将目的基因进行测序，结果显示，序列全长为1755bp，其核苷酸与国外和中国各地区流行株的同源性较高，介于98.4~99.8%之间，表明本研究成功克隆了CPV VP2基因。
　　 3．犬细小病毒VP2基因的原核表达及免疫反应性研究
　　 成功构建重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2，用克隆的CPV VP2基因转化到E.coli BL21中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western-Blotting分析，结果表明，诱导表达的pGEX-4T-VP2阳性菌株可表达出大小为90kDa蛋白，该重组蛋白具有反应活性。
　　 4．犬细小病毒VP2基因的原核表达条件优化和蛋白纯化及免疫原性研究
　　 为了确定VP2基因蛋白在大肠杆菌E. Coli BL21（DE3)中表达的最佳条件，对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度等条件进行优化。用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化出目的蛋白。
　　 纯化的目的蛋白四次免疫小白鼠，ELISA结果显示GST-VP2融合蛋白抗血清效价随着免疫次数的增加而升高，表明得到的重组蛋白具有很好的免疫原性。可作为犬细小病毒的基因工程亚单位疫苗候选者。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 犬细小病毒研究进展

第2章 犬细小病毒巢式PCR检测方法的建立及应用

第3章 犬细小病毒VP2基因的克隆与序列分析

第4章 犬细小病毒VP2基因在BL21表达及免疫反应性研究

第5章 犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白的纯化及免疫原性研究

第6章 结论

参考文献

附录

致 谢

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