共表达木糖代谢酶基因重组酿酒酵母的构建及发酵研究

摘要

木糖是木质纤维素中最重要的五碳糖组分,也是自然界仅次于葡萄糖的第二大糖源。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一。目前已发现的自然界存在的微生物菌株仍然不能满足商业化生产的需要。天然的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能有效利用葡萄糖发酵产生乙醇,但是不具备利用木糖的能力。利用新的技术和手段对酵母菌进行改造,提高其对木糖的发酵能力成为目前研究和开发的重点。
　　本研究通过基因工程的手段,将实验室已克隆得到的五个木糖代谢基因串联拼接至表达载体后引入酿酒酵母中,构建一株共发酵木糖和葡萄糖产生乙醇的重组工程菌。首先,利用融合PCR技术将来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的木糖还原酶基因(xyl1),热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因(xyl2),树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木酮糖激酶基因(xks1),以及酿酒酵母内源的转醛酶基因(tal1)和转酮酶基因(tkl1)进行拼接,得到了xyl1-xyl2-tal1(X12A)与xks1-tkl1(SK)连接片段。经过双酶切验证和T4连接反应,将获得的拼接片段克隆到酿酒酵母附加型质粒pAUR123载体上,成功构建了质粒 pAUR123-X12A( xyl1-xyl2-tal1)、pAUR123-SK(xks1-tkl1)。其次,以重组质粒pAUR123-X12A、pAUR123-SK为模版,设计含有酶切位点的引物,克隆出含有酶切位点的X12A与SK基因片段,经过双酶切及T4连接反应,以酿酒酵母附加型质粒pAUR123为载体,成功构建了含有xyl1、xyl2、tal1基因的质粒 pAUR123-X12A和含有xyl1、xyl2、tal1、xks1、tkl1基因的质粒pAUR123-XL(xyl1-xyl2-tal1-xks1-tkl1简写为XL),采用乙酸锂转化法对酿酒酵母INVSC1菌进行转化,通过抗性筛选获得阳性克隆。利用分子生物学手段对阳性克隆进行检测并获得含有重组质粒的工程菌S.c INVSC1-X12A和S.c INVSC1-XL。通过对目的蛋白进行检测,确定构建工程菌能同时表达已导入的木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因、木酮糖激酶基因、转醛酶基因和转酮酶基因,进而通过生化实验表明每种酶均具有一定活性,为木糖代谢研究提供了种质资源。
　　为进一步验证重组菌对木糖利用情况,将重组菌 S.c INVSC1-X12A和 S.c INVSC1-XL在以6％木糖为单一碳源进行发酵,发现重组菌能利用木糖,木糖的利用率分别为74.8%和79.5%,乙醇得率分别为31.14%和39.88%。在以不同配比的葡萄糖/木糖混和糖限氧培养基发酵条件下,重组菌的最佳的葡萄糖/木糖混和比为5:1,发酵时间为60h,此时S.c INVSc1-X12A乙醇得率为74.85%,糖利用率为96.61%,S.c INVSc1-XL乙醇得率为76.92%,糖利用率为96.78%。这表明,转入的近平滑假丝酵母的木糖还原酶基因,热带假丝酵母的木糖醇脱氢酶基因,树干毕赤酵母的木酮糖激酶基因,酿酒酵母内源的转醛酶基因和转酮酶基因所表达的蛋白质可以对酿酒酵母木糖发酵乙醇起到促进作用。

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第1章 绪论

1.1生物质能的研究意义

1.2生物质乙醇的研究现状

1.3纤维素类物质生产乙醇的现状

1.4自然界发酵木糖产乙醇的微生物

1.5微生物木糖代谢机理

1.6重组酿酒酵母发酵木糖研究现状

1.7立题意义

1.8研究内容

第2章 材料与方法

2.1材料

2.2实验方法

第3章 结果与分析

3.1木糖代谢酶基因的克隆

3.2目的基因的PCR拼接

3.3质粒pAUR123-X12A与pAUR123-SK的构建及测序

3.4质粒pAUR123-XL的构建与测序

3.5重组表达载体转入酵母菌株INVSc1

3.6粗酶液蛋白含量的测定

3.7 Western blot蛋白免疫

3.8重组菌酶活性的测定

3.9木糖梯度培养

3.10 以木糖为单一碳源的发酵评价

3.11 葡萄糖/木糖混合碳源发酵评价

第4章 讨论

第5章 结论与展望

参考文献

致谢

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