转基因羊外源基因甲基化及纳米载体转基因技术的研究

摘要

随着转基因技术的发展,目前在许多物种上都成功获得了转基因动物,但外源基因在转基因动物中的表达效率依然是转基因技术中的障碍之一。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,调节着机体的许多生物学过程。发生在启动子区域的甲基化修饰通常参与该基因在转录水平的表达调控。在转基因动物中,外源基因及其启动子的甲基化都可能影响着外源基因的表达。本实验室在前期的研究中通过体细胞克隆,干细胞克隆和卵周隙注射法分别获得转增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)、成纤维细胞内生长因子5(fibroblast growth factor5,FGF5)的转基因绵羊。本研究通过检测外源基因 eGFP、FGF5编码区及其启动子区的甲基化水平,并对外源蛋白表达效率进行相关性分析。结果表明,干细胞克隆外源基因启动子区的甲基化水平最高,其次是体细胞克隆,卵周隙注射法最低;而对于编码区的甲基化水平则随外源基因不同而存在差异,外源基因eGFP编码区的甲基化水平在卵周隙注射法中最高,其次是干细胞克隆;但外源基因FGF5编码区甲基化水平却在体细胞克隆最高。Western blot检测外源基因的蛋白表达水平,发现外源基因蛋白的表达量同其启动子区域的甲基化水平呈负相关性。结果提示不同的转基因方法可能会影响外源基因的甲基化水平,从而影响到外源基因的表达。
　　纳米材料可使吸附目的基因形成纳米基因复合物,通过内吞或吞噬作用进入细胞质,属于非病毒型基因载体系统,具有易于制备和安全性高等特点。本研究利用纳米材料作为载体探索转基因技术。首先克隆获得绵羊细胞重编程因子SOX2的cDNA序列并构建表达载体pLEX-SOX2-GFP。利用MgCl2、AlCl3、NaOH三种化合物制备直径约100 nm呈六边形双层片状结构的Mg2Al-Cl-LDH纳米颗粒。以纳米颗粒 Mg2Al-Cl-LDH结合pLEX-SOX2-GFP转染HEK293T,流式细胞仪检测GFP荧光信号评估转染效果。优化后的转染条件是:质粒DNA与LDH共孵育的时间在15min是转染效率最高(6.93％);质粒DNA与LDH的质量比为4:50时转染率最高(11.17%)。纳米材料浓度与转染效率呈正比,但同细胞的存活率呈反比,在200μg/ml为最佳浓度,细胞存活率最高(87%),转染后的培养时间24h时转染率最好(17.4%)。转染质粒在细胞内均有明显的绿色荧光蛋白的表达,说明该转染方法可靠,表达能力强。
　　总之,本研究发现转基因动物中外源基因蛋白的表达量同其启动子区域的甲基化水平呈负相关,提示不同的转基因方法可能会影响外源基因的表达水平。初步建立并优化了纳米材料转基因的新方法,为转基因动物生物技术的发展提供了新思路和奠定新基础。

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第1章 引言

1.1 转基因方法的研究近况

1.2 转基因的整合、表达及高效策略

1.3 转基因动物的表观遗传分析

1.4 研究目的及意义

第2章 不同方法生产的转基因动物的甲基化状况

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第3章 SOX-2基因真核表达载体的构建

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第4章Mg2Al-Cl-LDH纳米载体转基因技术的初步研究

4.1 试验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

参考文献

致谢

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