新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子检测及全序列测定

摘要

从表现花叶、畸形的加工番茄病株上获得分离物XJ124,用1对ToMV CP基因引物进行RT-PCR,扩增得到了689bp的特异性核苷酸片段。将PCR产物插入到克隆载体pMD18-T中再转化到大肠杆菌TOP10。经限制酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR产物大小相同的689bp的插入片段。cDNA全序列分析表明,所扩增出的689bp片段,含1个480bp开放阅读框架(ORF),编码160氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的ToMV CP基因。所测得的XJ124分离物与国内外已报道的部分ToMV CP基因序列比较,核苷酸同源性高达84.4％～99.8％,氨基酸同源性高达98.7％～100％。因此将该分离物XJ124鉴定为番茄花叶病毒。 本研究首次对来源于新疆加工番茄上的番茄分离物XJ124基因组全序列进行了测定,并与该属其它病毒序列进行了比对和分析。通过5次RT-PCR得到了XJ124(6,383个核昔酸)基因组的全序列。序列分析结果表明:XJ124全序列共6383个核苷酸：5'端和3'端非翻译区序列分别为71和206个核苷酸：中间为4个开放阅读框(0RF),分别编码4个蛋白,从5'端到3'端所编码的蛋白依次为1116个氨基酸(125.67kD,与病毒复制有关)、1,616个氨基酸(182.97kD,由125.67kD蛋白通读产生,与病毒复制有关)、264个氨基酸(28.94kD,与病毒移动有关)、159个氨基酸(17.59Dk,病毒衣壳蛋白)：其中ORF2和ORF3读框重叠,它们共用18个氨基酸；这些都与其它的Tobamoviruses非常相似。 本实验建立了新疆加工番茄花叶病病原TMV和ToMV的RT-PCR检测技术。应用该技术对采集于新疆加工番茄主要产区的病样本进行检测。结果表明：在2006年所采集的样本主要为条斑,各采样地点均检测到TMV,所占比例为54.43％；而能检测到的ToMV所占比例仅为13.92％,远远低于TMV所占比例。在2007年所采集的样本全部为花叶,各采样地点均检测到ToMv,所占比例为62.50％；而能检测到的TMv所占比例仅为20.83％,远远低于TMV所占比例。以上结果说明新疆加工番茄病毒病病原主要包括TMV和ToMV,并且症状与病原有一定关系,引起条斑症状的病原主要为TMV,而引起花叶的病原主要为ToMV。

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前 言

第一章文献综述

1.1番茄主要病毒病发生概况

1.1.1番茄病毒病田间症状及危害

1.1.2番茄病毒病的分布及种类

1.1.3新疆加工番茄番茄病毒病研究现状

1.2烟草花叶病毒属(Tobamovirus)及烟草花叶病毒的研究

1.2.1烟草花叶病毒属的生物学特性研究

1.2.2烟草花叶病毒属的分子生物学特性研究

1.2.3烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的全序列测定

1.2.4 ToMV研究进展

1.3番茄花叶病毒检测方法研究进展

1.3.1生物学检测法

1.3.2电子显微镜检测法

1.3.3分子生物学检测方法

1.4本论文研究目的及意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1毒源

2.1.2质粒和载体

2.1.3酶及试剂

2.1.4合成引物

2.2方法

2.2.1毒源的采集及保存

2.2.2 ToMV的分子鉴定

2.2.3 XJ124基因组全序列测定及分析

2.2.4病样ToMV和TMV的RT-PCR检测

第三章结果与分析

3.1新疆加工番茄分离物XJ124的分子鉴定

3.1.1基因组总RNA的提取

3.1.2 RT-PCR鉴定

3.1.3 RT-PCR的优化

3.1.4 XJ124 CP基因的克隆及鉴定

3.1.5 XJ124 CP基因序列测定

3.1.6 ToMV CP基因序列比较分析

3.2 XJ124基因组全序列测定及分析

3.2.1降落PER

3.2.2 XJ124各片段基因的克隆及鉴定

3.2.3 XJ124基因组的序列测定和分析

3.2.4 XJ124基因组的全序列分析

3.3病样ToMV和TMV的RT-PCR检测

3.3.1 RT-PCR检测

3.3.2病样RT-PCR检测结果

第四章结论与讨论

4.1首次在新疆加工番茄上用分子检测方法鉴定出ToMV

4.2对新疆加工番茄XJ124基因组进行了全序列测定和分析

4.3对新疆加工番茄病样进行了ToMV和TMV的RT-PCR检测

4.4降落PCR与常规RT-PCR的比较

参考文献

附录常用缓冲液及培养基配方

致 谢

作者简介及硕士期间发表的论文